Beyindeki sinapsların montajı ve spesifikasyonuyla ilgili araştırmalar, bu sürecin hala tam olarak anlaşılamadığını öne sürmektedir; ancak, bu makalede tartışılan çalışma, sinaps oluşumunu düzenlemenin bilinmeyen yönlerini aydınlatarak bilinenlere bir adım daha yaklaşmaktadır. Lphn3, Adgrl3 geni tarafından kodlanmaktadır ve hipokampüsteki Schaffer-collateral sinapslarının oluşumu sırasında presinaptik adezyon molekülleri olan teneurin ve FLRT ile postsinaptik bağlantıyı sağlayan bir G protein bağlı reseptördür (GPCR). Kriyo-elektron mikroskobu (cryo-EM) kullanılarak yapılan çalışmalar, Lphn3’ün birden fazla Gα ile etkileşimde bulunduğunu göstermiştir. Bu bağlamda, daha önceki araştırmalarda DHEB (dikkat eksikliği ve hiperaktivite bozukluğu) ile ilişkilendirilen bir protein olarak tanımlanmıştır.
Wang ve çalışma ekibi tarafından yürütülen bu araştırmada, Lphn3 geninin transkriptlerinin çeşitli alternatif splicing olaylarına maruz kaldığı ve bu süreç sonucunda bir dizi protein varyantının meydana geldiği ortaya konmuştur. Elde edilen varyantların farklı Gα protein alt birimlerine bağlandığı tespit edilmiştir. Ayrıca, bu araştırmada, Gα aracılığıyla cAMP üretimini sağlayan belirli varyantların, Gα sinyalleme, faz ayrılması ve transsinaptik ligand bağlanma yoluyla post-sinaptik elemanların bir araya getirilmesi üzerindeki düzenleyici rolüne odaklanılmıştır. Lphn3 geninin alternatif kırpılma (alternative splicing) olayları, özellikle E24, E30b, E31 ve E32 ekzonları oluşturan belirli bir bölgeyi içermektedir. Bu ekzonlar, Lphn3’ün farklı Gα protein alt birimlerine bağlanmayı mümkün kılan varyantları oluşturmaktadır. Oluşan bu varyantlar, E31 ekzonunu içerip içermeme durumlarına göre farklı Gα protein alt birimlerine (Gαs/Gα12/13) bağlanma eğilimindedir. Özellikle, E31 içeren varyantlar genellikle Gαs ile etkileşimde bulunurken, diğer izoformlar genellikle Gα12/13 ile etkileşimde görevlidir.
Lphn3 izoformunun sinaps oluşumundaki etkin rolünü belirlemeyi amaçlayan araştırmacılar, Lphn3’ün alternative splicinginde CRISPR Cas9 gen manipülasyonunu kullanarak E31’den E32’ye geçişi yönlendirmiş ve bu değişimin nöronal ağ aktivitesini bozduğunu tespit etmişlerdir. Bu gözlemleri doğrulamak adına, araştırmacılar üç bağımsız grupta üç farklı deney gerçekleştirilmiştir. Deneylerde yer alan gruplar şunlardır: kontrol grubu, Lphn3 KO (Lphn3’ün kodlanmadığı durum), E31 KO (E31 eksonu susturulmuş Lphn3). Yapılan deneylerde, kültüre edilmiş hipokampal nöronların aktivitesi Ca+2 kullanılarak ölçülmüş, ateşleme hızındaki düşüşün uyarıcı sinaps sayılarındaki azalmadan kaynaklanıp kaynaklanmadığı incelenmiş ve E31’in işlevini in vivo şartlarda genetik manipüle edilmiş başlatıcı nöronların bağlantılarını haritalamak amacıyla psödo tipi kuduz virüsünden yararlanarak monosinaptik retrograd izleme testi uygulanmıştır. Elde edilen sonuçlarda, Lphn3 KO ve E31 KO grupları arasında anlamlı bir ilişki belirlenmiş ve E31 içeren Lphn3’ün sinaptik bağlantıdaki gerekliliği ortaya konmuştur.
Araştırmacılar, E31 içeren Lphn3 varyantının G proteinine bağlanmasının yanı sıra SHANK adlı postsinaptik iskele proteini ile de etkileşimde bulunduğunu tespit etmiştir. Bu gözleme dayanarak, E31 varyantının GKAP, HOMER, PSD95 ve SHANK gibi postsinaptik iskele proteinleriyle kompleks oluşturması incelenmiş ve bu durum faz geçişli komplekslerin sedimentasyon analiziyle değerlendirilmiştir. Analiz sonuçları, alternatif olarak eklenen E31 varyantlı Lphn3’ün postsinaptik iskele protein yoğunlaştırmalarını arttırdığını göstermektedir. Buna ek olarak, Lphn3’ün alternative splicing ile oluşan varyantlarının hücre tipine özgü ve sinapsta birden çok görevi olduğunu göz önüne alınarak; E31 ve E32 varyantlarının nöronal aktivite ile düzenlenmesini incelenmiştir. Bu amaçla, kimyasal uyarı sonrası kültürde veya in vivo ortamda incelenen nöronlardan elde edilen üç yeni RNA-seq veri analizi gerçekleştirilmiştir. Bu analizler sırasında, nöronal aktivitenin arttığını ve bu artışın Fos miktarında bir artışa neden olduğu gözlemlenmiştir. Böylece artan nöronal aktivite, IEG düşük, IEG normal ve IEG yüksek olarak sınıflandırılmış ve elde edilen veriler ile E32 varyantlarının E31 varyantlarına dönüşümünün kademeli olarak geliştiği gösterilmiştir.
Sonuç olarak bu çalışma Lphn3 geninin farklı G proteinlere özelleşme, postsinaptik protein iskelelerini birleştirme ve nöronal aktiviteye duyarlılık açısından alternative splicing süreçlerine maruz kaldığını ortaya koymaktadır. cAMP uyarılmasına yanıt veren Gα‘ya bağlanan Lphn3 varyantının, sinaptik oluşumda cAMP sinyallemesini etkileyerek ve faz ayrılmış postsinaptik proteinlerin yoğunlaşmalarını birleştirerek önemli bir rol oynadığı belirlenmiştir. Bu keşifler, nöron aktivitesinin Lphn3’ün alternative splicing’ine olan etkisini de açığa çıkarmıştır. Elde edilen bu bulgular, Schaffer-collateral sinapslarının oluşumunu daha iyi anlamamıza ve gelecekteki sinaptik oluşumla ilgili çalışmalara önemli bir temel sağlamaktadır.
Yazar: Hayrullah Sade
Editör: Elif Duymaz
Referans: Wang, S., DeLeon, C., Sun, W., Quake, S. R., Roth, B. L., & Südhof, T. C. (2024). Alternative splicing of latrophilin-3 controls synapse formation. Nature. https://doi.org/10.1038/s41586-023-06913-9
-Bioinforange Bilimsel Haber Servisi-
Haber Yazıları, 20> Etki Faktörlü Q1 dergilerinde yayınlanan (listesi için tıklayınız)
bilimsel araştırmaların ekip arkadaşlarımız tarafından incelenip derlenmesi ile
hazırlanmaktadır.
MSc. Bioengineering
BSc. Mathematics