FOXP3, regülator T (Treg) hücrelerinin gelişiminde rol alan önemli bir transkripsiyon faktörüdür (TF) ve Treg hücreleri öz yapısında aşırı enflamasyonu ve otoimmüniteyi baskılamakla görevlidir; ancak FOXP3’ün moleküler mekanizmaları hala belirsizliğini korumaktadır.
FOXP3 transkripsiyon faktörü TnG tekrarlı mikrosatellitlere bağlanarak daha yüksek dereceli bir multimer oluşturabilmek için özel DNA bağlanma için forkhead (önçatal) alanını kullanmaktadır. FOXP3, T3G tekrarları içeren karmaşık bir yapıda merdiven benzeri bir mimariyi oluşturmakta; bu sayede çift sarmallı DNA molekülü, her bir çiftin bir ‘basamak’ oluşturduğu beş çift FOXP3 molekülü tarafından köprülenen iki ‘yan rayı’ oluşturmaktadır. FOXP3’ün ortologları ve paralogları benzer TnG tekrarlarını tanıma ve DNA köprüleme yeteneği sergilemektedir. Transkripsiyon faktörlerinin, sınırlı DNA bağlanma alanları repertuvarını nasıl kullandığı, henüz tam olarak çözülememiş bir sorudur.
İşlev kaybı mutasyonları ciddi çoklu organ otoimmün hastalığına, immün düzensizliğe, poliendokrinopatiye, enteropatiye ve X’e bağlı (IPEX) sendroma neden olabilmektedir ve bu durumda forkhead konsensüs motifi (FKHM) TGTTTAC dizisini tanımaktadır. FOXP3’den izole edilmiş forkhead alanı başlangıçta bilinmeyen bir domen-değişim dimeri olarak kristalize edilmiş olsa da, yakın zamanda yapılan bir çalışmada FOXP3’ün bir domen-değişim dimeri oluşturmadığı tespit edilmiştir. FOXP3’ün aslında hücrelerde hangi dizileri tanıdığı ve FOXP3’ün FKHM’den farklı yeni dizi motiflerini tanımak için daha önce bilinmeyen bir bağlanma yolunu kullanıp kullanamayacağı sorusu gündeme gelmiştir.
Zhang ve arkadaşları yaptıkları çalışmada, FOXP3 sekans spesifikliğini değerlendirmek amacıyla rekombinant FOXP3 proteini ile genomik DNA’nın tarafsız (unbiased) pull down işlemi gerçekleştirmiştir. Bu kapsamda fare EL4 hücrelerinden elde edilen genomik DNA önce parçalanmış (yaklaşık 100-200 bp’ye kadar), ardından saflaştırılmış ve MBP etiketli fare FOXP3 ile inkübe edilmiştir. Daha sonra, MBP pull down işlemi uygulanmış ve elde edilen DNA örnekleri birlikte saflaştırılmış, sonrasında ise yeni nesil sekanslama (NGS) yöntemi kullanılarak analiz tamamlanmıştır. Bu çalışmada, çinko parmak, coiled coil, RBR ve forkhead alanlarını içeren ancak N-terminal prolin bakımından zengin bölgeden yoksun rekombinant FOXP3 proteini (FOXP3(∆N)) kullanılmıştır. Elde edilen sonuçlar, FOXP3(∆N)’nin kontrol FOXP3 ile aynı uzunluktaki DNA özgüllüğünü sergilediğini göstermiştir.
TnG-tekrarı benzeri dizilerin, FOXP3-DNA etkileşimine katkıda bulunup bulunmadığını değerlendirmek amacıyla, C57BL/6J (B6) ve CAST/EiJ (Cast) fare suşlarının F1 melezleri kullanılarak elde edilen yayınlanmış FOXP3 CNR-seq (CNR-seq: Cleavage under targets and release using nuclease sequencing) verileri karşılaştırılmıştır. FOXP3 CNR-seq analizi sırasında alel dengesizliği gösteren 196 bölgenin 76’sında, en az bir alelde TnG-tekrarı benzeri elementler tespit edilmiştir. Bu oran, (%38,8) fare genomundakinden önemli ölçüde daha yüksektir. Ayrıca, dört bölge hariç tüm bölgeler, FOXP3 doluluğundaki alel yanlılığını yansıtan bir TnG tekrar uzunluğu sergilemiştir. Rastgele seçilen 50 bölgeden 25’er tanesi B6 ve Cast alel yanlı tepeleri içermekte olup, bu bölgeler FOXP3(∆N) pull down deney sonucu kullanılarak FOXP3 bağlanma etkinliği test edilmiştir. Deneylerden elde edilen çıktılar, TnG-tekrarı benzeri elementlerin in vitro ve in vivo FOXP3-DNA etkileşiminde önemli bir role sahip olduğunu göstermektedir.
FOXP3’ün T3G tekrarları üzerindeki multimer oluşturma mekanizmasını anlamak adına, FOXP3(∆N)’ün yapısı kriyo-elektron mikroskobu kullanılarak belirlenmiştir. Bu bağlamda, T3G tekrarları içeren bir kompleksin yapısal özellikleri ortaya çıkarılmıştır. Bu analizler neticesinde, IPEX mutasyonu ile işlev kaybına uğramış FOXP3(∆N/R337Q) yapısının, T3G tekrarları ile anlamlı bir etkileşim azalması sergilediği tespit edilmiştir. DNA köprüleme olayının sıvı ortamda gerçekleşip gerçekleşmediğini test etmek amacıyla, biyotinlenmemiş DNA’nın biyotinlenmiş DNA ile FOXP3 varlığında ve yokluğunda bir araya getirilmesi üzerine bir analiz yapılmıştır. Elde edilen sonuçlara göre, sadece FOXP3(∆N) varlığında biyotinlenmiş ve biyotinlenmemiş T3G tekrarları arasında DNA köprüleme gözlemlenmiştir. TnG tekrarı benzeri unsurların Homo sapiens ve Danio rerio genomlarında incelenmesi, bu tekrarların ökaryotlarda potansiyel transkripsiyonel işlevler için birlikte kullanılmış olabileceği ihtimalinin incelenmesi gerektiğini göstermektedir.
Sonuç olarak, bu araştırmada fare FOXP1, FOXP2 ve FOXP4 üyelerinin biyokimyasal analizi, bu faktörlerin özellikle T3G tekrarlarına bağlandığını ve FOXP3’te olduğu gibi T3G tekrar DNA’sını köprülediklerini ortaya koymuştur. TnG tekrarı benzeri sekanslar ve merdiven benzeri yapı tercihinin, FOXP3 paralogları ve ortologlarının korunmuş özellikleri arasında belirgin olduğunu; ancak bu özelliklerin tüm forkhead transkripsiyon faktörleri arasında genel olarak paylaşılmayabileceğini göstermektedir. Bu bulgular, FOXP ailesinin üyelerinin moleküler düzeyde benzer; ancak spesifik etkileşim profillerine sahip olduğunu vurgulayarak, hücresel düzeydeki fonksiyonel çeşitliliğin altında yatan mekanizmaların anlaşılmasına önemli bir katkı sağladığı düşünülmektedir.
Yazar: Əfsanə Baxışzadə
Editör: Elif Duymaz
Referans: Zhang, W., Leng, F., Wang, X. et al. FOXP3 recognizes microsatellites and bridges DNA through multimerization. Nature 624, 433–441 (2023). https://doi.org/10.1038/s41586-023-06793-z
-Bioinforange Bilimsel Haber Servisi-
Haber Yazıları, 20> Etki Faktörlü Q1 dergilerinde yayınlanan (listesi için tıklayınız)
bilimsel araştırmaların ekip arkadaşlarımız tarafından incelenip derlenmesi ile hazırlanmaktadır.
MSc. Bioengineering
BSc. Mathematics