Kümelenmiş düzenli aralıklı kısa palindromik tekrarlar (CRISPR) ve ilişkili proteini Cas enzimlerinden oluşan CRISPR-Cas sistemi, prokaryotların adaptif bağışıklık elemanlarından biridir. Günümüzde gen düzenleme dahil olmak üzere biyolojik bilimlerin çeşitli alt dallarında klinik ve moleküler araştırmalar için önemli bir araç haline gelmiştir. CRISPR sistemi kompleks bir yapıdadır ve bileşenlerine bağımlı olarak fonksiyonel farklılıklar göstermektedir. Bu yüzden iki sınıf altında toplanmaktadır; ancak en çok çalışılan ilişkili protein Cas9’dur. Cas9, prokaryotlarda temel olarak tek rehber RNA (sgRNA) aracılığıyla istilacı mikroorganizma genomunda protospacer bitişik motif (PAM) dizisi adı verilen bölgeleri tanıyarak RNA güdümlü endonükleaz aktivitesi göstermektedir. DNA’da çift zincir kırığı (DSB) Cas9’un RuvC ve HNH nükleaz alanları ile gerçekleşmektedir. Cas9 proteininin karakterizasyonu iyi yapılmış olsa da evrimi ve kökeni bilinmezliğini korumaktadır.
Alonso-Lerma ve arkadaşları, Streptococcus pyogenes CRISPR II-A alt tipi ile ilişkili Cas9’un (SpCas9) atalarının (anCas), evrimsel süreçler ve biyohesaplamalı analizler ile in vivo yeniden canlandırılmasını gerçekleştirmiştir. Öncelikle, SpCas9’un Firmicutes ve Actinobacteria şubelerinden 59 dizisi NCBI veri tabanından elde edilmiş ve bir filogenetik kronogram oluşturulmuştur. Daha sonra evrimsel köken analizleri için, SpCas9’un filogenetik düğümlerinden milyonlarca ve milyarlarca yıl öncesine ait; Firmicutes Ortak Atası (FCA), Basil Ortak Atası (BCA), Streptokok Ortak Atası (SCA), Piyojenik Ortak Ata (PCA) ve Pyogenes-Dysgalactiae Ortak Ataları (PDCA) seçilmiştir. Tüm dizilerin hizalanması sonucunda SpCas9 fonksiyonu için önemli aminoasit kalıntılarının anCas’dan günümüze nesiller boyu korunduğu tespit edilmiştir. Ek olarak, PAM dizisinin tanınmasında rol oynayan belirli konumdaki kalıntılarda FCA anCas, BCA anCas ve SpCas9 arasında farklılıklar gözlemlenmiştir.
anCas dizilerinin yapısal analizleri için AlphaFold2 yapı tahmini aracı kullanılmıştır.Her dizi için 5 yapısal model üretilmiş ve bu modeller hedef DNA ve gRNA’ya bağlı SpCas9 yapılarıyla hizalanarak karşılaştırılmıştır.Analiz sonuçları, FCA anCas ve SpCas9 için HNH alanlarının yer değiştirdiğini göstermiştir. Araştırmacılar, bu sonucun muhtemel bir DNA kırpma fonksiyon değişikliğine işaret edebileceğini belirtmiştir. Atomik konumların ortalama kare kök sapması (RMSD) kullanılarak HNH alanlarının yer değişimi doğrulanmıştır. Endonükleazın diğer bölgelerinin ataları ile güçlü bir homoloji içinde olduğu belirlenmiştir. anCas dizilerinin nükleaz aktivitesi için tasarlanan in vitro bölünme deneyinde, yaklaşık 2.6 milyar yaşında olan FCA anCas’tan günümüze geldikçe nikaz aktivitesinin azalarak DSB aktivitesinin yoğunlaştığı gösterilmiştir. PAM tanıma bölgeleri anCAS’larda yeni nesil dizileme (NGS) yöntemi ile incelendiğinde, FCA anCas’ın PAM dizisi gereksinimine ihtiyaç duymadığı ve evrimsel süreçlerde günümüze gelindikçe bu ihtiyacın arttığı keşfedilmiştir. sgRNA tanıma için de anCas’larda benzer bir farklılık olup olmadığı çeşitli sgRNA’lar kullanılarak “aşırı sarmal DNA substratı üzerinde in vitro bölünme deneylerinde” SpCas9 ile karşılaştırmalı olarak test edilmiştir. Araştırmacılar, FCA ve BCA anCas’larda rastgele sgRNa seçimi ile diğer tüm anCas ve SpCas9’da daha özgün sgRNA eğilimi gözlemlemiştir. Sonuçlar, evrimsel süreçlerin sgRNA tanımada Cas proteinlerini spesifikleştirdiği şeklinde değerlendirilmiştir.
anCas nükleazlarının tek zincirli DNA ve RNA üzerindeki etkileri in vitro bölünme deneylerinde, BCA anCas başta olmak üzere tüm anCas’ların RNA-kılavuzlu RNAzlara benzer bir aktivite gösterdiği ortaya çıkmıştır. ELISA deneyleri ile Anti-Cas9 antikorlarına cevapların BCA ve FCA anCas’larda SpCas9’a göre azaldığı belirlenmiştir. Son olarak araştırmacılar, sentetik olarak yeniden canlandırılan anCas’ların DNA kırpma işlevini, HEK293T insan hücrelerinde analiz etmiştir. Sonuçlar, anCas nükleazlarının genom düzenleme için potansiyellerini ortaya koymuştur.
Sonuç olarak bu çalışmada, CRISPR-Cas sistemlerinin geriye dönük evrimsel kökeni araştırılmıştır. Günümüzde oldukça karmaşık ve bakterilere özgü uyarlanmış olan bu sistemlerin antik dönemlerde bu kısıtlamalara sahip olmadığı ve özellikle insan uygulamaları için bağışıklık tepkisine daha ılımlı yanıtlar verdikleri keşfedilmiştir. Elde edilen veriler, Cas endonükleazlarının daha geniş uygulamalar için potansiyelini ortaya koymaktadır.
Yazar: İrem Coşkuntan
Editör: Sude Nur Arslan
Referans: Alonso-Lerma, B., Jabalera, Y., Samperio, S. et al. Evolution of CRISPR-associated endonucleases as inferred from resurrected proteins. Nat Microbiol 8, 77–90 (2023). https://doi.org/10.1038/s41564-022-01265-y
-Bioinforange Bilimsel Haber Servisi-
Haber Yazıları, 20> Etki Faktörlü Q1 dergilerinde yayınlanan (listesi için tıklayınız)
bilimsel araştırmaların ekip arkadaşlarımız tarafından incelenip derlenmesi ile hazırlanmaktadır.
Biyolog, Radyoterapi teknikeri. İstanbul Üniversitesi Aziz Sancar Deneysel Tıp Araştırma Enstitüsü / MSc. Genetik, doktora öğrencisi, İ.Ü. Bilgisayar Programcılığı öğrencisi.
İlgi alanları; inflamasyon genetiği, kanser genetiği, hücre biyolojisi, immünoloji, biyoinformatik, biyoistatistik, radyasyon onkolojisi.