CRISPR, Gen Düzenlemenin Ötesine Geçiyor: Programlanabilir Biyosensör Sistemlerine Evriliyor

Özet

Sentetik biyoloji, biyolojik sistemlerin yeniden tasarlanmasını ve hücresel davranışların genetik devreler aracılığıyla programlanmasını sağlayan disiplinler arası bir alandır. Son yıllarda CRISPR-Cas teknolojisi, gen düzenleme teknolojileriyle birleşerek yüksek özgüllük ve duyarlılığa sahip programlanabilir biyosensör platformlarına dönüşmüştür. Cas12, Cas13, Cas14 ve dCas9 gibi farklı efektör proteinlerin özgün hedef tanıma ve kollateral kesim mekanizmaları; nükleik asit tespiti için SHERLOCK, DETECTR ve HOLMES gibi moleküler tanı sistemlerinin geliştirilmesini sağlamıştır. Bu yeni teknolojiler, uygun numune hazırlama ve sinyal okuma stratejileriyle laboratuvar dışı ve bakım noktası uygulamalarına uyarlanabilmekte; hedef nükleik asitlerin hızlı ve özgül tespitine olanak sağlayabilmektedir. Bu platformlar; floresan, kolorimetrik, elektrokimyasal ve lateral-flow (LFA) sinyal okuma yöntemleriyle birleştirilerek klinik tanı, viral patojen tespiti ve gıda güvenliği alanlarında kullanılmaktadır. Yapay zekâ, nanoteknoloji ve bakım noktası testlerinin (POCT) entegrasyonu ise tanısal hassasiyeti ve erişilebilirliği artırmaktadır. Bu derlemede; sentetik biyoloji, genetik devreler, CRISPR tabanlı biyosensörlerin çalışma ilkeleri, sinyal okuma teknolojileri, biyomedikal uygulamaları ve gelecekteki tanısal potansiyelleri incelenmektedir.

Anahtar Kelimeler: Sentetik biyoloji, programlanabilir canlılar, CRISPR-Cas, biyosensör, moleküler tanı, sinyal okuma sistemleri, genetik devreler.

Giriş

Sentetik biyoloji; moleküler biyoloji, genetik mühendisliği ve sistem biyolojisinden yararlanarak biyolojik yapıların yeniden tasarlanmasını ve işlevsel biyolojik sistemlerin geliştirilmesini amaçlayan disiplinler arası bir araştırma alanıdır¹.

Eskiden hücreler ağırlıklı olarak doğal işlevleri üzerinden incelenirken, sentetik biyolojideki gelişmelerle hücresel davranışların genetik devreler aracılığıyla programlanması mümkün hâle gelmiştir. Bu devreler sayesinde hücrelerin belirli sinyalleri algılaması, gen ekspresyonunu düzenlemesi ve koşula bağlı biyolojik yanıtlar oluşturması tasarlanabilmektedir².

Bu yaklaşım, hücrelerin terapötik amaçlarla kullanılmasının da önünü açmış; özellikle programlanmış bakterilerin tümör bölgesini hedefleyerek lizis gerçekleştirmesi ve terapötik proteinleri kontrollü biçimde salması, sentetik biyolojinin akıllı ilaç taşıma sistemlerindeki potansiyelini ortaya koymuştur³.

Ancak sentetik biyolojide genetik devrelerin veya CRISPR tabanlı sistemlerin çalışacağı uygun konak organizmanın (şasi) seçilmesi önemli bir tasarım aşamasıdır. Şasinin genetik olarak düzenlenebilir ve hedeflenen işlevi güvenli biçimde gerçekleştirebilir olması beklenir. Bu nedenle genom açıklaması; genlerin, düzenleyici bölgelerin ve operonların belirlenmesi yoluyla konağın genetik ve işlevsel özelliklerinin değerlendirilmesini sağlamaktadır⁴. Özellikle terapötik uygulamalarda çevreye yayılım, bağışıklık yanıtı ve genetik devrelerin kararlılığı gibi biyogüvenlik sorunları da dikkate alınmalı ve uygun biyolojik kontrol mekanizmaları değerlendirilmelidir⁵

Programlanabilir biyosensörlerin geliştirilmesi, farklı genetik bileşenlerin birlikte nasıl çalıştığının anlaşılmasını gerektirmektedir. Bu noktada yapay zekâ ve makine öğrenmesi, büyük deneysel veri kümelerinden yararlanarak genetik devrelerin daha doğru ve verimli tasarlanmasını sağlamaktadır. Böylece biyolojik devreler açık döngülü, ileri beslemeli, geri beslemeli veya bellekli sistemler olarak programlanabilmektedir².

CRISPR-Cas, virüslerden gelen yabancı DNA veya RNA’yı tanıyıp parçalamak için evrimleşmiştir. Araştırmacılar ise bu özelliği, gen düzenleme yerine moleküler tanı (molecular diagnostics) amacıyla kullanacak şekilde yeniden tasarlamışlardır.

Bu özellikler, CRISPR-Cas sistemlerinin gen düzenlemenin yanı sıra programlanabilir moleküler tanı ve biyosensör platformları olarak da kullanılmasının önünü açmıştır⁶. CRISPR/Cas sistemlerinin biyosensör teknolojilerine entegrasyonu, moleküler tanı alanında yüksek özgüllük ve duyarlılığa sahip yeni nesil tanı platformlarının geliştirilmesini sağlamıştır. CRISPR tabanlı biyosensörlerin nanomalzemelerle entegrasyonu, bu sistemlerin performansının geliştirilmesine katkı sağlayabilecek bir yaklaşım olarak değerlendirilmektedir. Kullanılan sinyal algılama yöntemine göre bu platformlar floresan, kolorimetrik ve elektrokimyasal biyosensörler olarak sınıflandırılabilmektedir. Son yıllarda geliştirilen SHERLOCK, DETECTR (Cas12 tabanlı) ve E-CRISPR gibi platformlar ise farklı Cas proteinlerinin özelliklerinden yararlanarak nükleik asitlerin hızlı, hassas ve güvenilir şekilde tespit edilmesine olanak tanımaktadır⁷,⁸.

Genetik Devreler

Genetik devreler, hücrelerin belirli biyolojik veya çevresel sinyalleri algılamasını, bu sinyalleri değerlendirmesini ve önceden tanımlanmış bir biyolojik yanıt oluşturmasını sağlayan sentetik düzenleyici sistemlerdir. Bu devreler; promotörler, operatörler, transkripsiyon faktörleri, riboregülatörler ve diğer düzenleyici genetik elemanların belirli bir mantık doğrultusunda bir araya getirilmesiyle oluşturulur. Günümüzde elektronik devrelere benzer şekilde çalışan genetik devreler, mantık kapıları (AND, OR, NOT, NAND vb.), geri besleme mekanizmaları ve biyolojik bellek sistemleri gibi işlevsel bileşenler içerebilir. Böylece hücreler yalnızca çevresel uyarıları algılamakla kalmayıp birden fazla biyobelirteci aynı anda değerlendirebilmektedir. Bu özellikleri sayesinde genetik devreler, programlanabilir canlıların geliştirilmesinde ve CRISPR tabanlı biyosensörlerin tasarımında temel bir rol oynamaktadır⁵,⁹,².

Sensörler, hücre içi veya dışı kimyasal ve fiziksel sinyalleri algılayan genetik olarak kodlanmış protein veya RNA molekülleridir. Hesaplama elemanları, girdi-çıktı ilişkisini belirleyerek çoğunlukla transkripsiyon faktörleri ve hedef promotörler aracılığıyla sinyali işlemektedir. Çıktılar ise gen ekspresyonu, transkripsiyon sonrası düzenleme, metabolik yol aktivasyonu veya protein salgılanması gibi biyolojik yanıtlar şeklinde gerçekleşebilir⁵.

CRISPR Tabanlı Biyosensörler

CRISPR tabanlı biyosensörlerde farklı Cas proteinlerinin hedef tanıma ve kesim özelliklerinden yararlanılarak DNA veya RNA dizilerinin tespit edilmesi amaçlanmaktadır. Bu kapsamda Cas9, Cas12, Cas13 ve Cas14 gibi farklı efektör proteinler, sahip oldukları moleküler özelliklere bağlı olarak farklı biyosensör platformlarının geliştirilmesinde kullanılmaktadır¹⁰.

Cas Protein Çeşitliliği ve Etki Mekanizmaları

Cas12

Cas12a başta olmak üzere Cas12 ailesindeki efektörler, özellikle DNA hedeflerinin tespitine yönelik biyosensörlerin geliştirilmesinde kullanılmaktadır. Hedef DNA’nın tanınmasının ardından Cas12’nin trans-kesim aktivitesi tetiklenmekte ve hedef dışı tek iplikli DNA molekülleri parçalanabilmektedir. Bu özellik, floresan veya diğer sinyal üreten raporlayıcı moleküllerin parçalanması yoluyla ölçülebilir bir sinyal oluşturulmasını sağlamaktadır¹¹,¹².

Bu nedenle Cas12 sistemleri, bulaşıcı hastalıklar, genetik bozukluklar ve kanserle ilişkili biyobelirteçlerin tespitine yönelik biyosensörlerin geliştirilmesinde yaygın olarak kullanılmaktadır¹¹,¹³.

Cas13

Cas13 sistemleri RNA hedeflerinin tespitinde öne çıkmaktadır. Hedef RNA’nın tanınması, Cas13’ün kollateral RNA kesim aktivitesini tetiklemektedir. Bu mekanizma, RNA tabanlı raporlayıcı moleküllerin parçalanması yoluyla ölçülebilir bir sinyal oluşturulmasını sağlamaktadır¹⁴.

Cas13 tabanlı biyosensörler özellikle viral RNA’ların ve kodlamayan RNA’ların tespitinde önemli bir potansiyele sahiptir. Kodlamayan RNA’ların çeşitli hastalıklarla ilişkili biyobelirteçler olarak değerlendirilmesi, Cas13 sistemlerinin erken tanı ve tedavi izlemi açısından kullanılmasını desteklemektedir¹⁴.

Cas14

Cas14, küçük yapılı bir CRISPR efektörü olması ve tek iplikli DNA hedefleriyle ilişkili nükleaz aktivitesi nedeniyle CRISPR tabanlı nükleik asit tespit sistemlerinde değerlendirilen alternatif Cas proteinlerinden biridir. Bu sistemlerin farklı hedef moleküllere yönelik kullanılabilmesi, CRISPR tabanlı biyosensörlerin yalnızca tek bir tespit mekanizmasına bağlı kalmadan çeşitlendirilmesine olanak sağlamaktadır¹⁰.

Cas9 ve dCas9

Cas9, kılavuz RNA tarafından belirlenen DNA dizisini tanıyan ve hedef DNA’yı kesebilen RNA-kılavuzlu bir endonükleazdır. Katalitik olarak etkisizleştirilmiş Cas9 (dCas9) ise DNA’yı kesmeden hedef dizilere bağlanabildiği için nükleik asit tespiti, gen ekspresyonunun düzenlenmesi ve genomik bölgelerin görüntülenmesi gibi uygulamalarda kullanılabilmektedir⁷,¹⁵,¹⁶. Temel avantajı, genomun istenen bölgelerini hedefleyebilmesi ve bu sayede genom düzenleme ile gen onarımı gibi çeşitli uygulamalarda kullanılabilmesidir. Ek olarak nükleik asit analizi, protein analizi, küçük molekül analizi, hücre analizi ve diğer yönlerde biyolojik analiz alanında da kullanılmaktadır⁷,¹⁵.

Bunun yanında katalitik olarak etkisizleştirilmiş Cas9 (dCas9), DNA’yı kesmeden kılavuz RNA aracılığıyla hedef DNA dizilerine bağlanarak genomik lokusların izlenmesi ve hedefe bağlı sinyal üretimi gibi uygulamalarda kullanılabilmektedir. Böylece dCas9 tabanlı sistemlerde hedef DNA’nın varlığı, uygun bir raporlayıcı veya sinyal üretim mekanizması aracılığıyla ölçülebilir hâle getirilebilmektedir¹³,¹⁶.

Moleküler Tanı Platformları

SHERLOCK

SHERLOCK, Cas13 tabanlı bir moleküler tanı platformudur. Sistem, hedef RNA’nın tanınması ve Cas13’ün kollateral RNA kesim aktivitesinden yararlanmaktadır. İzotermal amplifikasyon yöntemleriyle birleştirilebilen bu platform, floresan veya lateral-flow analizi yoluyla sinyal oluşturabilmektedir¹⁵,¹⁷.

SHERLOCK sisteminin yüksek duyarlılığı ve farklı RNA hedeflerine uyarlanabilir olması, özellikle enfeksiyon hastalıklarının hızlı tespitinde kullanım potansiyelini artırmıştır¹⁷.

DETECTR

DETECTR, Cas12a’nın hedef DNA’yı tanıma ve trans-kesim aktivitesinden yararlanan bir moleküler tanı yaklaşımıdır. Hedef nükleik asidin tanınmasının ardından Cas12a’nın aktive olması, raporlayıcı moleküllerin parçalanmasına ve ölçülebilir bir sinyalin oluşmasına neden olmaktadır¹⁵,¹⁸.

HOLMES ve HOLMESv2

HOLMES ve HOLMESv2 sistemlerinde sırasıyla Cas12a ve Cas12b proteinlerinden yararlanılmaktadır. Bu platformlar, farklı CRISPR-Cas sistemlerinin hassas nükleik asit tespitinde kullanılabileceğini göstermektedir¹⁵.

Bu farklı CRISPR-Cas sistemlerinin floresan, kolorimetrik ve elektrokimyasal sinyal okuma yöntemleriyle birleştirilmesi, yüksek özgüllüğe sahip ve farklı kullanım koşullarına uyarlanabilen biyosensör platformlarının geliştirilmesini sağlamaktadır. Son yıllarda bu sistemlerin taşınabilir okuyucular, lateral-flow şeritleri ve diğer miniaturize teknolojilerle birleştirilmesi ise CRISPR tabanlı biyosensörlerin hızlı ve bakım noktası testi (POCT) uygulamalarındaki kullanım potansiyelini artırmıştır¹³,¹⁹.

Tanısal ve Biyomedikal Uygulama Örnekleri

Biyosensörler biyolojik veya kimyasal bir analitin varlığını ya da konsantrasyonunu ölçülebilir bir sinyale dönüştürerek tespit etmeye yarayan analitik sistemlerdir. Günümüzde biyosensörler; hastalıkların tanı ve takibi, çevresel kirleticilerin tespiti, ilaç geliştirme, patojenlerin belirlenmesi ve hastalıklarla ilişkili biyobelirteçlerin analiz edilmesi gibi birçok alanda kullanılmaktadır^7,8,20.

Aynı zamanda biyotıp, ilaç keşfi, çevre ve gıda güvenliği, savunma ve güvenlik alanlarında kullanımının da büyük önem taşıdığı yüksek verimli biyolojik tespit testleridir²¹.

CRISPR-Cas Tabanlı Biyosensörlerin SARS-CoV-2 Tespitinde Kullanımı

SARS-CoV-2 tespitinde öncelikle nazofaringeal, orofaringeal sürüntü veya tükürük örneklerinden viral RNA elde edilmekte ve hedef bölgeye özgü crRNA/gRNA tasarlanmaktadır. Düşük miktardaki hedef RNA’nın tespiti için RT-PCR (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction), RT-RPA (Reverse Transcription Recombinase Polymerase Amplification) veya RT-LAMP (Reverse Transcription Loop-Mediated Isothermal Amplification) amplifikasyon yöntemlerinden yararlanılabilmektedir. Cas13 tabanlı sistemlerde hedef RNA’nın tanınması kollateral RNA kesim aktivitesini tetikleyerek raporlayıcı RNA’ların parçalanmasına ve sinyal oluşmasına neden olur. Cas12a tabanlı sistemlerde ise RNA hedefinin uygun bir ters transkripsiyon ve/veya amplifikasyon basamağıyla DNA formuna aktarılmasının ardından hedef DNA’nın tanınması, kollateral ssDNA kesimini ve buna bağlı sinyal oluşumunu tetikler. OR-DETECTR ise H1N1 ve SARS-CoV-2 nükleik asitlerinin aynı reaksiyon formatında tespitine yönelik geliştirilmiş Cas12 tabanlı bir tanı yaklaşımıdır^22,23,10.

HPV Tespitinde CRISPR/Cas12a Tabanlı Biyosensörler

HPV-16 DNA’sının tespitinde, Cas12a’nın trans-kesim aktivitesini DNA tetrahedron nanoyapılarıyla birleştiren elektrokemilüminesans (ECL) tabanlı bir biyosensör geliştirilmiştir. Hedef DNA’nın tanınmasıyla aktive olan Cas12a, tetrahedral DNA yapısını parçalayarak ECL sinyalinde değişime neden olmakta ve böylece amplifikasyon gerektirmeden kantitatif tespit sağlanmaktadır. Bu yaklaşım, Cas12a’nın trans-kesim aktivitesinin farklı sinyal dönüştürme platformlarıyla birleştirilerek nükleik asit tespitinde kullanılabileceğini göstermektedir^16,24.

Manyetik Gevşeme Anahtarlama (MRS) Biyosensörleri

CRISPR/Cas12a’nın MRS platformlarına entegrasyonu, hedef nükleik asitlerin özgül tanınmasını manyetik relaksasyon sinyaliyle birleştirerek hassas ve amplifikasyonsuz patojen tespitine olanak sağlamaktadır²⁵.

Gıda güvenliğinde kullanılan manyetik gevşeme anahtarlama (MRS) biyosensörleri, karmaşık örneklerde ayırma ve saflaştırma gerektirmeden farklı analitlerin tespitinde kullanılabilmektedir. Bu sistemlerde süperparamanyetik manyetik nanopartiküllerin (MNP) dağılma, kümelenme veya konsantrasyon değişimleri ölçülerek hedef analit belirlenmektedir. Örneğin, zaman alanı nükleer manyetik rezonans (TD-NMR) tabanlı bir MRS biyosensörü ile sütte Salmonella 90 dakika içerisinde 2,3 × 10³ CFU/mL tespit limitiyle belirlenmiştir²⁶.

Sinyal Okuma Sistemleri

CRISPR-Cas tabanlı biyosensörlerde hedef nükleik asidin tanınması sonucunda meydana gelen moleküler olayın ölçülebilir bir çıktıya dönüştürülmesi, sistemin analitik olarak kullanılabilmesi için temel aşamalardan biridir. Bu amaçla CRISPR-Cas mekanizması; floresan, kolorimetrik, elektrokimyasal ve spektroskopik gibi farklı sinyal okuma yaklaşımlarıyla birleştirilebilmektedir. Kullanılan yöntem, yalnızca hedef molekülün tespit edilmesini değil, aynı zamanda elde edilen sinyalin duyarlılığı, analiz süresi ve cihaz gereksinimleri gibi özellikleri de belirlemektedir^27,28,6.

Floresan sistemler

Özellikle Cas12 ve Cas13’ün trans-kesim aktivitesinden yararlanılarak floresan işaretli raporlayıcıların parçalanması ve ölçülebilir bir sinyal oluşturulması sağlanmaktadır. Bu yöntem yüksek duyarlılık sunmasına karşın özel optik okuyucular gerektirebilmektedir^20,29.

Kolorimetrik sistemler

CRISPR-Cas aktivitesi, gözle veya basit görüntüleme cihazlarıyla değerlendirilebilen renk değişimine dönüştürülmektedir. Düşük cihaz gereksinimi nedeniyle bu yaklaşım, özellikle hızlı ve taşınabilir testler için avantaj sağlamaktadır³⁰.

Elektrokimyasal sistemler

Hızlı yanıt, düşük cihaz gereksinimi ve taşınabilirlik potansiyelleri nedeniyle elektrokimyasal yaklaşımlar POC testleri için avantaj sağlayabilmektedir. Mikroakışkanlar, iletken malzemeler ve CRISPR/Cas ile entegrasyonları, PCR gerektirmeyen hızlı nükleik asit tespitine olanak sağlamaktadır^31,32.

CRISPR aracılı hedef tanıma olayı, elektrot yüzeyindeki elektriksel değişimler üzerinden ölçülmektedir. Akım, potansiyel veya empedans gibi parametrelerdeki değişimler kullanılabilmekte ve bu sistemler taşınabilir cihazlara uyarlanabilmektedir³³.

Lateral-flow tabanlı sistemler

Cas12 veya Cas13 tarafından gerçekleştirilen hedef tanıma ve kollateral kesim aktivitesi, test şeridinde görsel olarak değerlendirilebilen bir sinyale dönüştürülmektedir. Bu sistemler hızlı sonuç vermeleri, kolay uygulanabilmeleri ve karmaşık cihaz gereksinimini azaltabilmeleri nedeniyle özellikle POCT ve kaynakları sınırlı ortamlarda kullanım için uygun bir yaklaşım sunmaktadır. Güncel çalışmalar, CRISPR–LFA sistemlerinin duyarlılık ve özgüllüğünü artırmanın yanında çoklu hedef tespiti ve ticarileşme olanaklarını da geliştirmeye odaklanmaktadır¹⁸.

Spektroskopik sistemler

Özellikle yüzeyle güçlendirilmiş Raman spektroskopisi (SERS), CRISPR-Cas aracılı hedef tanıma olayını Raman sinyalindeki değişim üzerinden değerlendirmektedir. SERS’in yüksek duyarlılığı ve düşük örnek hacimleriyle çalışabilmesi, bu yöntemin CRISPR tabanlı nükleik asit biyosensörlerinde kullanılmasını desteklemektedir³⁴.

Sonuç

CRISPR tabanlı biyosensör ve görüntüleme teknolojilerinin nanoteknoloji ve yapay zekâ ile entegrasyonu, test tasarımı, veri analizi ve biyobelirteç keşfini geliştirerek daha akıllı ve otonom tanı çözümlerinin geliştirilmesine katkı sağlaması beklenmektedir.Ayrıca CRISPR yaklaşımlarının çoklu-omik ve uzamsal analizlerle birleştirilmesi, biyolojik süreçlerin moleküler, fonksiyonel ve mekânsal özelliklerinin daha kapsamlı incelenmesine yönelik yeni araştırma olanakları sunmaktadır³⁵,³⁶,³⁷,⁶.

Sinyal okuma yönteminin seçimi; duyarlılık, özgüllük, analiz süresi, maliyet, cihaz gereksinimi ve taşınabilirlik gibi faktörlere göre de değişmektedir³⁸.

Örneğin; hedef moleküllerin neden olduğu optik değişimleri kullanarak düşük maliyetli ve hassas algılama olanağı sunan LC (sıvı kristal) tabanlı biyosensörlerin akıllı teknolojilerle entegrasyonu, gelecekte taşınabilir ve kullanıcı dostu biyosensörlerin geliştirilmesine katkı sağlayabilir²¹.

CRISPR/Cas tabanlı biyosensörlerin araştırma ortamından rutin klinik uygulamalara aktarılabilmesi için bazı teknik ve uygulamaya yönelik sorunların giderilmesi gerekmektedir. Özellikle karmaşık klinik örneklerde güvenilir sonuç elde edilmesi, numune hazırlama basamaklarının basitleştirilmesi ve farklı örnek türlerinde yöntemin doğrulanması, klinik kullanım açısından önem taşımaktadır. Ayrıca farklı CRISPR/Cas sistemlerinin ve sinyal üretim yaklaşımlarının standartlaştırılması, sonuçların farklı platformlar arasında karşılaştırılabilirliğinin sağlanması ve geliştirilen sistemlerin gerçek klinik örnekler üzerinde kapsamlı olarak değerlendirilmesi gerekmektedir. Bu gereksinimlerin karşılanması, CRISPR/Cas tabanlı biyosensörlerin deneysel düzeyden klinik tanı uygulamalarına geçişini destekleyebilir^8,39,15.

Yapay zekâ, CRISPR tabanlı biyosensörlerin tasarımı, sinyal analizi ve tanısal süreçlerin optimizasyonunu destekleyebilecek bir yaklaşım sunmaktadır. Makine öğrenimi ve derin öğrenme yöntemleri, biyolojik verilerden yararlanarak biyobelirteçlerin belirlenmesi, sensör tasarımının optimize edilmesi ve tanısal modellerin geliştirilmesine katkı sağlayabilir. Böylece YZ–CRISPR entegrasyonu, yalnızca test geliştirme aşamasında değil, klinik uygulama ve halk sağlığı izlemi süreçlerinde de kullanılabilen daha uyarlanabilir tanı sistemlerinin geliştirilmesini mümkün kılmaktadır^35,1.

Yazar: Rojin Son

Editör: Hazel Birgül

REFERANSLAR

1. Chang, K., Sun, J., Bao, Q., Fu, X., Ping, J., et al. (2026). Engineering synthetic biology sensors with artificial intelligence: From programmable circuits to next-generation biosensing. Biotechnology Advances. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2026.108874
2. Müller, M. M., Arndt, K. M., & Hoffmann, S. A. (2025). Genetic circuits in synthetic biology: Broadening the toolbox of regulatory devices. Frontiers in Synthetic Biology, 3, Article 1548572. https://doi.org/10.3389/fsybi.2025.1548572
3. Qian, Y., McBride, C., & Del Vecchio, D. (2018). Programming cells to work for us. Annual Review of Control, Robotics, and Autonomous Systems, 1, 411–440. https://doi.org/10.1146/annurev-control-060117-105052
4. Hamese, S., Mugwanda, K., Takundwa, M., Prinsloo, E., & Thimiri Govinda Raj, D. B. (2023). Recent advances in genome annotation and synthetic biology for the development of microbial chassis. Journal of Genetic Engineering and Biotechnology, 21(1), 156. https://doi.org/10.1186/s43141-023-00598-3
5. Inda, M. E., & Lu, T. K. (2020). Microbes as biosensors. Annual Review of Microbiology, 74, 337–359. https://doi.org/10.1146/annurev-micro-022620-081059
6. Huang, S., Dai, R., Zhang, Z., Zhang, H., Zhang, M., Li, Z., Zhao, K., Xiong, W., Cheng, S., Wang, B., & Wan, Y. (2023). CRISPR/Cas-based techniques for live-cell imaging and bioanalysis. International Journal of Molecular Sciences, 24(17), 13447. https://doi.org/10.3390/ijms241713447
7. Kumaran, A., Serpes, N. J., Gupta, T., James, A., Sharma, A., Kumar, D., Nagraik, R., Kumar, V., & Pandey, S. (2023). Advancements in CRISPR-based biosensing for next-gen point of care diagnostic application. Biosensors, 13(2), 202. https://doi.org/10.3390/bios13020202
8. Irkham, I., Ibrahim, A. U., Pwavodi, P. C., Nwekwo, C. W., & Hartati, Y. W. (2024). CRISPR-based biosensor for the detection of Marburg and Ebola virus. Sensing and Bio-Sensing Research, 43, 100601. https://doi.org/10.1016/j.sbsr.2023.100601
9. Nielsen, A. A. K., & Keasling, J. D. (2016). Engineering cellular metabolism. Cell, 164(6), 1185–1197. https://doi.org/10.1016/j.cell.2016.02.004
10. Zhou, J., Li, Z., Olajide, J. S., & Wang, G. (2024). CRISPR/Cas-based nucleic acid detection strategies: Trends and challenges. Heliyon, 10(4), e26179. https://doi.org/10.1016/j.heliyon.2024.e26179
11. Du, K., Zeng, Q., Jiang, M., Hu, Z., Zhou, M., & Xia, K. (2025). CRISPR/Cas12a-based biosensing: Advances in mechanisms and applications for nucleic acid detection. Biosensors, 15(6), 360. https://doi.org/10.3390/bios15060360
12. Sahel, D. K., Giriprasad, G., Jatyan, R., Guha, S., Korde, A., Mittal, A., Bhand, S., & Chitkara, D. (2024). Next-generation CRISPR/Cas-based ultrasensitive diagnostic tools: Current progress and prospects. RSC Advances, 14(44), 32411–32435. https://doi.org/10.1039/D4RA04838E
13. Rahimi, S., Balusamy, S. R., Perumalsamy, H., Ståhlberg, A., & Mijakovic, I. (2024). CRISPR-Cas target recognition for sensing viral and cancer biomarkers. Nucleic Acids Research, 52(17), 10040–10067. https://doi.org/10.1093/nar/gkae736
14. Zhu, T., Jiang, W., Wu, Y., Fang, R., Deng, F., & Yang, D. (2025). Advances in CRISPR/Cas13a-based biosensors for non-coding RNA detection. Talanta, 294, 128223. https://doi.org/10.1016/j.talanta.2025.128223
15. Wang, Z., Wang, Q., Zhang, J., Li, B., Li, Y., Chen, Z., Guo, D., & Feng, S. (2025). CRISPR-driven diagnostics: Molecular mechanisms, clinical efficacy and translational challenges. Clinical and Translational Medicine, 15(10), e70482. https://doi.org/10.1002/ctm2.70482
16. Hu, K., Yin, W., Bai, Y., Zhang, J., Yin, J., Zhu, Q., & Mu, Y. (2024). CRISPR-based biosensors for medical diagnosis: Readout from detector-dependence detection toward naked eye detection. Biosensors, 14(8), 367. https://doi.org/10.3390/bios14080367
17. Pan, Z., Xu, L., Fan, Z., Cao, Y., & Ren, F. (2026). CRISPR-based diagnostics for infectious diseases: Mechanisms, advancements and clinical transformation prospects. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology, 16, 1769226. https://doi.org/10.3389/fcimb.2026.1769226
18. Hall, T., Gulati, S., Sang, R., Jia, Z., Mckinnirey, F., Vesey, G., Goldys, E., & Deng, F. (2025). CRISPR biosensing with lateral flow assays for point of care diagnostics: Overcoming commercial development challenges. TrAC Trends in Analytical Chemistry, 189, 118275. https://doi.org/10.1016/j.trac.2025.118275
19. Xin, X., Su, J., Cui, H., Wang, L., & Song, S. (2025). Recent advances in clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated proteins system-based biosensors. Biosensors, 15(3), 155. https://doi.org/10.3390/bios15030155
20. Huang, D., Xu, C., Jiang, C., Chen, Q., Xu, Z., & Fang, X. (2024). Advances and challenges of signal readout systems in CRISPR-based biosensors for point-of-care testing of nucleic acid. TrAC Trends in Analytical Chemistry, 178, 117856. https://doi.org/10.1016/j.trac.2024.117856
21. Khoshbin, Z., Abnous, K., Taghdisi, S. M., & Verdian, A. (2021). Liquid crystal-based biosensors as lab-on-chip tools: Promising for future on-site detection test kits. TrAC Trends in Analytical Chemistry, 142, 116325. https://doi.org/10.1016/j.trac.2021.116325
22. Huang, Z., Tian, D., Liu, Y., Lin, Z., Lyon, C. J., Lai, W., Fusco, D., Drouin, A., Yin, X., Hu, T., & Ning, B. (2020). Ultra-sensitive and high-throughput CRISPR-powered COVID-19 diagnosis. Biosensors and Bioelectronics, 164, 112316. https://doi.org/10.1016/j.bios.2020.112316
23. Nazir, S. (2023). Recent progress of molecular diagnosis via CRISPR Cas-based biosensors and bioassays. Talanta Open, 7, 100225. https://doi.org/10.1016/j.talo.2023.100225
24. Yu, L., Peng, Y., Sheng, M., Wang, Q., Huang, J., & Yang, X. (2023). Sensitive and amplification-free electrochemiluminescence biosensor for HPV-16 detection based on CRISPR/Cas12a and DNA tetrahedron nanostructures. ACS Sensors, 8(7), 2852–2858. https://doi.org/10.1021/acssensors.3c00806
25. Shen, Y., Jia, F., He, Y., Fu, Y., Fang, W., Wang, J., & Li, Y. (2022). A CRISPR-Cas12a-powered magnetic relaxation switching biosensor for the sensitive detection of Salmonella. Biosensors and Bioelectronics, 213, 114437. https://doi.org/10.1016/j.bios.2022.114437
26. Borah, H., Bashir, O., Pawase, P. A., Mondal, I. U. H., Várallyay, S., Ungai, D., & Kovács, B. (2025). Exploring the versatility of Magnetic Relaxation Switching (MRS) and CRISPR-based biosensors for the detection of foodborne pathogens: A comprehensive review. Applied Food Research, 5(2), 101190. https://doi.org/10.1016/j.afres.2025.101190
27. Cui, J., Cheng, X., Guo, X., Li, D., Xu, Z., Qian, W., Wang, Z., & Dai, Z. (2026). Recent advances in CRISPR/Cas-based electrochemical biosensors for pathogen detection. TrAC Trends in Analytical Chemistry, 196, 118638. https://doi.org/10.1016/j.trac.2025.118638
28. Jiang, W., Zhu, T., Zhou, S., Pan, L., Qiao, Z., Wang, M., & Yang, D. (2025). Recent advances in electrochemical-based CRISPR/Cas biosensing for nucleic acid and non-nucleic acid pathogenic microorganism detection. Food Research International, 221, 117213. https://doi.org/10.1016/j.foodres.2025.117213
29. Li, B., Zhai, G., Dong, Y., Wang, L., & Ma, P. (2024). Recent progress on the CRISPR/Cas system in optical biosensors. Analytical Methods, 16(6), 798–816. https://doi.org/10.1039/D3AY02147E
30. Chen, J., Su, H., Kim, J. H., Liu, L., & Liu, R. (2024). Recent advances in the CRISPR/Cas system-based visual detection method. Analytical Methods, 16(39), 6599–6614. https://doi.org/10.1039/D4AY01147C
31. Phan, Q. A., Truong, L. B., Medina-Cruz, D., Dincer, C., & Mostafavi, E. (2022). CRISPR/Cas-powered nanobiosensors for diagnostics. Biosensors and Bioelectronics, 197, 113732. https://doi.org/10.1016/j.bios.2021.113732
32. Xie, S., Yue, Y., & Yang, F. (2024). Recent advances in CRISPR/Cas system-based biosensors for the detection of foodborne pathogenic microorganisms. Micromachines, 15(11), 1329. https://doi.org/10.3390/mi15111329
33. Wachholz Junior, D., & Kubota, L. T. (2024). CRISPR-based electrochemical biosensors: An alternative for point-of-care diagnostics? Talanta, 278, 126467. https://doi.org/10.1016/j.talanta.2024.126467
34. Zhang, J., Chen, Z., Lv, H., et al. (2024). Recent advances in CRISPR/Cas systems-associated surface enhanced Raman spectroscopy biosensor towards nucleic acid detection. Medicine in Novel Technology and Devices, 24, 100336. https://doi.org/10.1016/j.medntd.2024.100336
35. Zhou, Z., Cho, I. H., & Kadam, U. S. (2025). CRISPR-Cas-based diagnostics in biomedicine: Principles, applications, and future trajectories. Biosensors, 15(10), 660. https://doi.org/10.3390/bios15100660
36. Liang, Y., Tong, S., Zhang, J., Tan, G. Y., Zhang, L., Lee, S. Y., & Tong, Y. (2025). Expanding horizons of CRISPR applications beyond genome editing. Trends in Genetics, 41(10), 934–953. https://doi.org/10.1016/j.tig.2025.06.003
37. Binan, L., Jiang, A., Danquah, S. A., Valakh, V., Simonton, B., Bezney, J., Manguso, R. T., Yates, K. B., Nehme, R., Cleary, B., & Farhi, S. L. (2025). Simultaneous CRISPR screening and spatial transcriptomics reveal intracellular, intercellular, and functional transcriptional circuits. Cell, 188(8), 2141–2158.e18. https://doi.org/10.1016/j.cell.2025.02.012
38. Yang, Y., Li, X., Wang, X., Wang, Z., & Gong, S. (2025). CRISPR-Cas-based colorimetric strategies for nucleic acids detection. TrAC Trends in Analytical Chemistry, 182, 118058. https://doi.org/10.1016/j.trac.2024.118058
39. Zavvar, T. S., Khoshbin, Z., Ramezani, M., Alibolandi, M., Abnous, K., & Taghdisi, S. M. (2022). CRISPR/Cas-engineered technology: Innovative approach for biosensor development. Biosensors and Bioelectronics, 214, 114501. https://doi.org/10.1016/j.bios.2022.114501

Bioinforange