1. Genom Çapında Kromatin Erişilebilirliğinin Belirlenmesi ve ATAC-seq Tekniği
İnsan genomunda yaklaşık iki metre uzunluğundaki DNA, histon proteinleri üzerine paketlenerek nükleozomları oluşturmakta ve nükleozomların organizasyonuyla kromatin yapısı meydana gelmektedir. Kromatin organizasyonu ve erişilebilirliği, gen ekspresyonunun düzenlenmesinde temel bir role sahiptir. Genom çapında kromatin erişilebilirliğinin tespiti için geçmişte yaygın olarak DNase I duyarlı bölge dizilemesi (DNase-seq) ve Regülatör Elemanların Formaldehit Aracılı İzolasyonu (FAIRE-seq) protokolleri tercih edilmiştir. Ancak bu klasik yaklaşımlar; jel saflaştırma ve adaptör ligasyonu gibi çok adımlı süreç içerdiklerinden ötürü potansiyel veri kaybına yol açabilmektedir. Dizileme yoluyla transpozaza erişilebilir kromatin analizi olan ATAC-seq (Assay for Transposase-Accessible Chromatin using sequencing), Tn5 transpozaz aracılığıyla DNA’nın parçalanması ve adaptör dizilerinin eklenmesini aynı reaksiyonda gerçekleştirmesi nedeniyle örnek hazırlama sürecinde daha hızlı, verimli, zaman ve maliyet tasarrufu sağlayan bir alternatif sunmaktadır.
2. Tn5 Transpozaz Aracılı Moleküler Etiketleme ve Bölünme Mekanizması
ATAC-seq yönteminin temel mekanizması hiperaktif Tn5 transpozaz enziminin “kes-yapıştır” faaliyetine dayanmaktadır. Enzim, kromatinin açık veya kapalı olma durumuna bağlı olarak erişilebilir bölgelere bağlanmaktadır. Tn5 transpozaz, erişilebilir kromatin bölgelerinde DNA’yı keserken aynı zamanda dizileme adaptörlerini DNA uçlarına eklemektedir. Yöntem; ChIP-seq, DNase-seq, mikrokokal nükleaz dizilemesi (MNase-seq) ve nükleozom yerleşimi ve metilom dizilemesi (NOMe-seq) gibi diğer klasik dizileme yöntemlerinden ayrışmaktadır.
3. ATAC-seq Laboratuvar Protokolü Aşamaları
ATAC-seq yöntemi üç ana deneysel adımdan oluşmaktadır. İlk olarak nükleusların hazırlanması aşamasında hücrelerin lizis tamponu ile parçalanarak çekirdeklerinin toplanması gerçekleştirilmektedir. İkinci olarak transpozaz reaksiyonu ve saflaştırma aşamasında hiperaktif Tn5 transpozazı ortama eklenerek açık DNA bölgeleri etiketlenmekte, ardından bir sonraki amplifikasyon aşamasına geçiş için DNA saflaştırılmaktadır. Son olarak PCR amplifikasyonu ve kütüphane oluşumu aşamasında etiketlenmiş DNA parçaları, polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) protokolü kullanılarak çoğaltılmakta ve yeni nesil dizilemeye uygun kütüphaneler elde edilmektedir.
4. Yüksek Çözünürlüklü ve Özelleşmiş ATAC-seq Çeşitleri
2013 yılından itibaren standart ATAC-seq protokolü temel alınarak farklı hücresel ve moleküler ihtiyaçlara yönelik çeşitli modifikasyonlar geliştirilmiştir. scATAC-seq (Tek Hücreli ATAC-seq), tek hücre çözünürlüğünde, hücre tipine özgü kromatin erişilebilirlik haritalarının çıkarılmasına olanak tanımaktadır. mATAC-seq (Metil ATAC-seq), DNA metilasyon profillerine odaklanarak metilasyon analizlerinde kromatin erişilebilirliğinin daha güvenilir bir şekilde tespit edilmesini sağlamaktadır. Omni-ATAC-seq, klasik yönteme kıyasla doku bazlı regülasyonların daha net analiz edilmesini sağlamakta ve donmuş doku örneklerinden yüksek verimle analiz yapılmasına imkan tanımaktadır. Fast-ATAC-seq, birincil kan hücrelerindeki kromatin erişilebilirliğinin incelenmesi amacıyla standart protokolden özelleştirilmiştir. Literatürde ayrıca protein indeksli tek hücreli ATAC-seq (pi-ATAC-seq), küçük molekül inhibitörü Pitstop2 temelli scip-ATAC-seq, transkript indeksli ATAC-seq (T-ATAC-seq), Perturb ATAC-seq, hücresel indekslemeli dsciATAC-seq, nano-well tabanlı μATAC-seq ve uzamsal (spatial) ATAC-seq teknikleri yer almaktadır.
5. Çeşitli Omik Yöntemleriyle Kombine Entegre Analizler
Biyolojik süreçlerin daha kapsamlı anlaşılması amacıyla ATAC-seq, diğer dizileme teknolojileriyle birlikte kullanılmaktadır. Transkriptom analizini sağlayan RNA-seq ve epigenetik işaretleri saptayan ChIP-seq ile entegre edilen ATAC-seq verileri, karmaşık biyolojik problemlerin çözümüne katkı sağlayabilmektedir. Özellikle ChIP-seq ve ATAC-seq kombinasyonu, kromatin düzenleyicilerinin detaylı analizinde ve ikiden fazla numune analizinin karşılaştırılmasında önem taşımaktadır. ChIP-seq’in ikiden fazla numune analizinin karşılaştırılmasında ortaya çıkabilecek olası problemler için ATAC-seq ile birlikte kullanılması önem taşımaktadır. Bunların yanı sıra, Sci-CAR yöntemi ile Sci-ATAC-seq ve Sci-RNA-seq birleştirilerek çok sayıdaki tek hücrede kromatin erişilebilirliğinin analiz edilmesi sağlanabilmektedir.
6. Embriyonik Gelişim, Hücresel Yaşlanma ve Onkolojik Uygulamalar
Kromatin erişilebilirlik haritalaması, embriyolojik gelişim ve hücresel yaşlanma süreçlerinin yanı sıra çeşitli hastalıkların moleküler temelinin araştırılmasında kullanılmaktadır. ATAC-seq aracılığıyla kutanöz T hücreli lenfoma, akut miyeloid lösemi, pankreas kanseri ve özafagus adenokarsinomu gibi malignitelerde kromatin değişiklikleri ve düzenleyici bölgeler analiz edilmiştir. Ayrıca ATAC-seq ve FAIRE-seq kanser araştırmalarında önemli olup, bu yöntemlerle özellikle tümör kaynaklı düzenleyici bölgeler analiz edilebilmektedir. Canlı hücrelerde kromatin yapısının en az bozulmayla incelenebilmesi için geliştirilen “plaka üstü ATAC-seq” yöntemi ile 96 kuyucuklu plakalar üzerinde Tn5 transpozaz uygulaması yapılarak ATP’ye bağımlı kromatin yeniden modelleme kompleksi olan BAF kompleksinin açık kromatin bölgelerindeki etkisi saptanabilmektedir.
Yüksek verimli bir dizileme teknolojisi olan ATAC-seq, gelişen modifikasyonları ve diğer omik yöntemleriyle entegrasyon kapasitesi sayesinde hücresel regülasyonların ve hastalık mekanizmalarının aydınlatılmasında geleceğe yönelik umut verici bir araç niteliği taşımaktadır.
Derleyen: Gizem Akcagündüz
Editör: Ayzer Yıldırgan
