Özet

Proteinlerin üç boyutlu yapılarının hesaplamalı olarak tahmin edilmesi, yapısal biyolojinin temel problemlerinden biri olarak uzun süre değerlendirilmiş; derin öğrenme yöntemlerinin gelişmesiyle birlikte bu alanda önemli ilerlemeler sağlanmıştır. AlphaFold 2 ile protein dizisinden yüksek doğruluklu yapı tahminlerinin mümkün hâle gelmesinin ardından AlphaFold 3, proteinlerin yanı sıra nükleik asitler, küçük moleküller, iyonlar ve modifiye kalıntılar içeren biyomoleküler komplekslerin ortak olarak modellenmesine olanak sağlayan difüzyon tabanlı bir mimari sunmuştur. Bununla birlikte, protein-ligand etkileşimlerinin yalnızca tek bir statik kompleks üzerinden temsil edilmesi, ligand bağlanması sırasında ortaya çıkan konformasyonel değişimler, indüklenmiş uyum, konformasyonel seçicilik ve kriptik bağlanma cepleri gibi biyofiziksel süreçlerin açıklanması açısından 

önemli sınırlılıklar taşımaktadır. Bu derlemede AlphaFold 3’ün mimari özellikleri ve kompleks yapı tahminindeki performansı; bağımsız kıstaslarla ortaya konan fiziksel geçerlilik ve genelleme sorunları; akış eşleştirme, eşdeğişken difüzyon ve esnek docking yaklaşımları; GPCR, antikor-antijen ve PROTAC ternary kompleksleri gibi uygulama-özgül sistemlerdeki performans; ayrıca yapı temelli ilaç keşfi ve RNA hedefleri açısından ortaya çıkan fırsatlar birlikte ele alınmaktadır. Literatür, AlphaFold 3 ve ilişkili modellerin statik kompleks tahmininde önemli bir ilerleme sağladığını, ancak yeni ligand kimyası, büyük konformasyonel yeniden düzenlenmeler, allosterik bağlanma, fiziksel geçerlilik ve bağlanma afinitesi gibi problemlerde hâlâ belirgin metodolojik açıkların bulunduğunu göstermektedir. Bu nedenle gelecekteki yaklaşımın, yapay zekâ temelli üretici modellerin moleküler dinamik, fizik tabanlı arıtma, deneysel yapılar ve fonksiyonel verilerle bütünleştirildiği hibrit modelleme çerçevelerine yönelmesi beklenmektedir.

Anahtar Kelimeler: yapı tahmini, protein-ligand etkileşimi, difüzyon modeli, moleküler docking, konformasyonel ansambl, kriptik cep, yapı temelli ilaç tasarımı, biyomoleküler yapay zekâ

1. Giriş

Proteinlerin üç boyutlu yapılarının amino asit dizisinden hesaplamalı olarak tahmin edilmesi, biyofizik, yapısal biyoloji ve biyoinformatik alanlarının uzun süreli problemlerinden biri olmuştur. Deneysel yapı belirleme yöntemleri yüksek çözünürlüklü bilgiler sağlayabilmekle birlikte, X-ışını kristalografisi ve kriyo-elektron mikroskopisi gibi yöntemlerin uygulanması hedefe, örnek hazırlama koşullarına ve deneysel erişilebilirliğe bağlı olarak zaman ve kaynak gerektirebilmektedir. Protein dizilerinin sayısındaki hızlı artış ile deneysel olarak çözümlenmiş yapıların sayısı arasındaki fark, hesaplamalı yapı tahmininin önemini daha da artırmıştır. AlphaFold’un 2021 yılında yayımlanan ikinci nesil mimarisi, çoklu dizi hizalamaları ve geometrik kısıtların derin öğrenme ile bütünleştirilmesi sayesinde deneysel yapılara yaklaşan doğruluk düzeylerinin elde edilebileceğini göstermiştir.¹ AlphaFold tarafından sağlanan yüksek doğruluklu modellerin insan proteomunun büyük bölümüne uygulanması, daha önce deneysel olarak yapısı belirlenmemiş proteinler için yapısal hipotezlerin geniş ölçekte üretilmesine olanak sağlamıştır.²

Bununla birlikte, tek bir proteinin yapısının tahmin edilmesi ile proteinlerin biyolojik bağlamları içerisinde diğer moleküllerle etkileşimlerinin modellenmesi aynı problem değildir. Protein-ligand etkileşimlerinde ligandın kimyasal özellikleri, bağlanma cebinin geometrisi, yan zincir rotamerleri, su molekülleri, elektrostatik çevre ve protein konformasyonunun bağlanma öncesi ve sonrası değişimi birlikte rol oynayabilmektedir. Dolayısıyla yüksek doğruluklu bir apo-protein yapısının bulunması, bu yapının belirli bir ligandın bağlanma pozunu güvenilir biçimde sağlayacağı anlamına gelmemektedir.

AlphaFold 3 ile birlikte yapı tahmininin kapsamı önemli ölçüde genişletilmiştir. Model, proteinlerin yanı sıra DNA, RNA, küçük moleküller, iyonlar ve modifiye kalıntıları aynı kompleks içerisinde modelleyebilen difüzyon tabanlı bir mimari olarak geliştirilmiştir.³ Böylece protein ve diğer biyomoleküler bileşenlerin kompleks  yapı tahmininin bütünleşik bir çerçevede ele alınmasına olanak sağlamıştır.

AlphaFold 3’ün bu genişletilmiş kapsamı, özellikle yapı temelli ilaç tasarımı açısından dikkat çekici bir potansiyel oluşturmuştur. Bununla birlikte, geliştirici çalışmada elde edilen yüksek performans değerlerinin bağımsız veri kümeleri ve farklı değerlendirme ölçütleri kullanılarak yeniden incelenmesi, modelin gerçek dünya koşullarındaki güçlü ve zayıf yönlerinin belirlenmesi açısından gerekli hâle gelmiştir. Bu gereksinim, yalnızca kristalografik RMSD gibi geometrik ölçütlere dayalı değerlendirmelerin fiziksel olarak geçersiz moleküler yapıların gözden kaçmasına neden olabileceğini gösteren PoseBusters çalışmaları ve daha geniş kapsamlı bağımsız kıstas çalışmalarının ortaya çıkmasına yol açmıştır.⁴˒⁵

Proteinlerin işlevlerinin çoğu zaman tek bir konformasyon tarafından değil, birden fazla yapı durumun katkısını içerebilir. Proteinlerin ligand bağlanması sırasında konformasyonel değişiklik geçirmesi de AlphaFold 3 sonrası dönemin temel sorunlarından biri olarak öne çıkmaktadır. Proteinlerin ligand bağlanması sırasında konformasyonel değişiklik geçirmesi, bağlanma cebinin açılması veya kapanması, uzak bölgelerde allosterik yeniden düzenlemelerin ortaya çıkması ve normalde çözücüye erişilemeyen kriptik ceplerin geçici olarak oluşması, tek bir yapı tahmininin biyolojik sistemi tam olarak temsil etmesini zorlaştırmaktadır. Protein yapısal ansambllerinin belirlenmesine ilişkin klasik biyofiziksel çalışmalar da biyolojik durumların tek bir enerji minimumu yerine çoklu konformasyonlar üzerinden değerlendirilmesi gerektiğini göstermektedir.⁶

Bu nedenle son yıllarda iki tamamlayıcı yönelim belirginleşmiştir. İlk yönelimde, AlphaFold 3 gibi modellerin tek seferlik kompleks tahmini yerine daha geniş bir konformasyonel uzayın örneklenmesi amaçlanmaktadır. AlphaFlow ve ESMFlow gibi akış eşleştirme temelli yaklaşımlar, tek durumlu yapı tahmin modellerini üretici konformasyon modellerine dönüştürerek bu problemi ele almaktadır.⁷ İkinci yönelimde ise ligand bağlanmasıyla birlikte protein konformasyonunun değiştirilmesi doğrudan docking probleminin parçası hâline getirilmektedir. DynamicBind, NeuralPLexer ve benzeri yöntemler bu doğrultuda geliştirilmiştir.⁸˒⁹

Bu derlemede AlphaFold 3’ün statik kompleks tahminindeki konumu ile dinamik protein-ligand etkileşimlerini modellemeye yönelik yeni nesil yaklaşımlar birlikte değerlendirilmektedir. Öncelikle AlphaFold 3’ün mimarisi ve genel performansı incelenmekte, ardından bağımsız kıstaslarla ortaya konan sınırlılıklar ele alınmaktadır. Daha sonra protein konformasyonel ansambllerinin ve ligand-özgül protein yapı değişimlerinin modellenmesi tartışılmakta; GPCR’ler, antikor-antijen kompleksleri ve PROTAC ternary kompleksleri gibi biyolojik olarak önemli sistemlerdeki uygulamalar değerlendirilmektedir. Son olarak bu gelişmelerin yapı temelli ilaç keşfi ve nükleik asit hedeflerine yönelik çalışmalar üzerindeki etkileri ele alınmaktadır.

2. AlphaFold 3’ün Mimari Temelleri, Statik Kompleks Tahmini ve Bağımsız Değerlendirmeler

2.1. AlphaFold 2’den AlphaFold 3’e Geçiş

AlphaFold 2’nin temel başarısı, amino asit dizilerindeki evrimsel bilgiyi çoklu dizi hizalamalarıyla birleştiren derin öğrenme mimarisinin üç boyutlu yapı tahminine uygulanmasıyla elde edilmiştir.¹ Bu yaklaşımda evrimsel bilgi ile yapısal kısıtların birlikte modellenmesi, proteinlerin üç boyutlu yapılarının yüksek doğrulukla tahmin edilmesine katkıda bulunmuştur. Ancak bu mimari esas olarak protein yapısına odaklanmış ve küçük moleküller veya diğer biyomoleküler bileşenlerin aynı genel yapılandırma sürecinde modellenmesini sınırlı bırakmıştır.

AlphaFold 3 ile birlikte bu yaklaşımın kapsamı biyomoleküler komplekslere genişletilmiştir.³ Modelin önemli özelliklerinden biri, kompleks içerisindeki atomların başlangıçta gürültülü koordinatlarla temsil edilmesi ve difüzyon süreci aracılığıyla yapısal olarak anlamlı üç boyutlu koordinatlara doğru dönüştürülmesidir. Bu yaklaşım, tek bir deterministik koordinat tahmini yerine bir olasılıksal üretim sürecinin kullanılmasına olanak sağlamaktadır.

AlphaFold 3’ün protein-ligand komplekslerinde elde ettiği performans, özellikle geleneksel docking yaklaşımlarıyla karşılaştırıldığında dikkat çekmiştir. Geliştirici değerlendirmesinde protein-ligand etkileşimleri, protein-nükleik asit kompleksleri ve antikor-antijen etkileşimleri gibi farklı görevlerde önceki uzmanlaşmış yöntemlere kıyasla belirgin performans kazanımları bildirilmiştir.³ Bununla birlikte, bu sonuçların belirli kıstas setleri ve eğitim verisiyle ilişkili olduğu unutulmamalıdır.

AlphaFold 3’ün geliştirici çalışmasında PoseBusters veri setinde ligand RMSD temelli performansın yüksek olduğu rapor edilmiştir.³ Ancak RMSD değerlerinin tek başına moleküler yapının fiziksel olarak geçerli olup olmadığını göstermemesi, bağımsız değerlendirmelerde farklı bir performans görünümünün ortaya çıkmasına neden olmuştur.⁴

2.2. Bağımsız Kıstaslar ve Genelleme Problemi

AlphaFold 3’ün bağımsız olarak değerlendirilmesi, modelin eğitim verisine benzerliği yüksek hedeflerdeki performansıyla yeni biyolojik sistemlerdeki performansı arasındaki farkın anlaşılması açısından önem taşımaktadır. Kapsamlı bir düşük homolojili kıstaslama çalışmasında 1.522 biyolojik montaj dokuz farklı yapı tahmini görevi altında değerlendirilmiş ve AlphaFold 3’ün genel olarak güçlü performans gösterdiği, ancak antikor-antijen kompleksleri, allosterik protein-ligand sistemleri ve nükleik asitlerin hâlâ zorlayıcı olduğu ortaya konmuştur.⁵

Bu bulgu, modelin “genel amaçlı” olarak tanımlanmasının her moleküler sınıfta aynı düzeyde genelleme sağlandığı anlamına gelmediğini göstermektedir. Özellikle ligand kimyasının eğitim verisinden uzaklaşmasıyla tahmin doğruluğunun azalması, veri dağılımı ile model performansı arasındaki ilişkinin önemini ortaya koymaktadır.⁵

Docking alanındaki daha geniş kapsamlı PoseBench değerlendirmeleri de benzer bir problemi göstermiştir. Apo proteinlerden holo komplekslere geçiş, çoklu ligand içeren hedefler ve yeni bağlanma pozlarının tahmini gibi gerçek dünya koşullarında derin öğrenme temelli yöntemlerin performansının azalabildiği bildirilmiştir.⁸ Bu sonuç, yalnızca deneysel olarak çözülmüş holo yapıların yeniden oluşturulmasını değil, deneysel yapısı bulunmayan proteinlerde yeni ligand bağlanma modlarının tahmin edilmesini hedefleyen yöntemlerin daha zor bir problemle karşı karşıya olduğunu göstermektedir.

DockGen gibi daha sıkı genelleme testleri de makine öğrenmesi temelli docking modellerinin daha önce görülmemiş protein sınıflarına aktarımında önemli güçlükler yaşadığını göstermiştir.¹⁰ Veri ve model ölçeğinin artırılması ile sentetik eğitim verilerinin kullanılmasının genelleme performansını iyileştirebildiği bildirilmiş olmakla birlikte, bu sonuçlar kör docking probleminin hâlen çözülmüş olmadığını göstermektedir.¹⁰

Bu noktada AlphaFold 3’ün başarısı, “doğru yapı tahmini” ile “yeni kimyasal ve biyolojik durumlara genelleme” kavramlarının birbirinden ayrılması gerektiğini göstermektedir. Bir modelin bilinen yapısal dağılım içerisinde yüksek doğruluk sağlaması, eğitim dağılımının dışında kalan yeni ligandlar, yeni protein aileleri veya büyük konformasyonel değişimler için aynı güvenilirliğin korunacağı anlamına gelmemektedir.

2.3. Açık Kaynaklı Alternatifler ve Model Çeşitliliğinin Artması

AlphaFold 3 sonrasında açık kaynaklı all-atom yapı tahmin modellerinin sayısında belirgin bir artış gözlenmiştir. RoseTTAFold All-Atom, proteinler, nükleik asitler, küçük moleküller, metaller ve kovalent modifikasyonları aynı modelleme çerçevesinde ele alabilen bir mimari olarak geliştirilmiştir.¹¹ Ayrıca RFdiffusion All-Atom aracılığıyla küçük moleküller çevresinde protein tasarımının gerçekleştirilmesi ve deneysel olarak doğrulanan bağlayıcıların üretilmesi gösterilmiştir.¹¹

Chai-1, proteinler, nükleik asitler ve küçük molekülleri içeren komplekslerin tahminine yönelik çok modlu bir temel model olarak geliştirilmiş ve açık erişimli model ağırlıkları ile çıkarım kodu sunulmuştur.¹² Bu yaklaşımda deneysel kısıtların modele eklenebilmesi, hesaplamalı tahmin ile deneysel biyofiziksel bilginin birleştirilmesi açısından önem taşımaktadır.

Boltz-1 de AlphaFold 3 sonrasında geliştirilen önemli açık modellerden biri olmuştur.¹³ Boltz-2 ile birlikte yapı tahminine ek olarak protein-ligand bağlanma afinitesinin doğrudan tahmin edilmesine yönelik bir bileşenin eklenmesi, yapı tahmini ile fonksiyonel niceliklerin aynı modelleme çerçevesinde ele alınması yönünde önemli bir adım oluşturmuştur.¹⁴

Protenix ise AlphaFold 3 mimarisinin kapsamlı biçimde yeniden uygulanmasına yönelik açık bir çalışma olarak sunulmuş ve protein-ligand, protein-protein ve protein-nükleik asit tahminlerinde farklı kıstaslarda değerlendirilmiştir.¹⁵ Bu tür açık kaynaklı uygulamalar, yalnızca erişilebilirliği artırmakla kalmamakta, aynı zamanda bağımsız araştırmacılar tarafından eğitim verisinin, mimari tercihlerin ve değerlendirme protokollerinin daha ayrıntılı biçimde incelenmesine olanak sağlamaktadır.

Dolayısıyla AlphaFold 3 sonrası dönem tek bir modelin baskın olduğu bir yapıdan ziyade, benzer genel amaçlı mimarilerin farklı eğitim stratejileri, veri kümeleri ve çıkarım protokolleriyle karşılaştırıldığı bir ekosisteme doğru ilerlemektedir. Bu çeşitlilik, gelecekte performansın tek bir modelin mutlak başarısı üzerinden değil, hedefe özgü kıstaslar ve bağımsız veri kümeleri üzerinden değerlendirilmesini daha önemli hâle getirmektedir.

3. Fiziksel Geçerlilik, Dinamiklik ve Konformasyonel Ansambl Problemi

3.1. PoseBusters ile Fiziksel Geçerliliğin Yeniden Tanımlanması

Moleküler docking çalışmalarında ligandın deneysel bağlanma moduna ne kadar yakın olduğunun belirlenmesinde RMSD uzun süredir kullanılan temel ölçütlerden biridir. Ancak ligandın kristal yapıdaki konumuna yakın olması, oluşturulan moleküler yapının kimyasal açıdan geçerli olduğu anlamına gelmemektedir. PoseBusters çalışması, derin öğrenme tabanlı docking modellerinin bazı durumlarda fiziksel olarak geçersiz yapılar üretebildiğini göstermiştir.⁴

PoseBusters kapsamında moleküler formül, bağlanabilirlik, stereokimya, tetrahedral kirallik, çift bağ geometrisi ve diğer kimyasal-geometrik özellikler değerlendirilmiştir.⁴ Böylece ligand RMSD’sinin yanında bir tahminin kimyasal olarak mümkün olup olmadığı da değerlendirme sürecine dahil edilmiştir.

Bu yaklaşımın önemi, derin öğrenme modellerinin eğitim sırasında istatistiksel olarak sık karşılaşılan geometrileri öğrenebilmesine karşın fiziksel enerji fonksiyonlarını açık biçimde temsil etmeyebilmesiyle ilişkilidir. Moleküler mekanik kuvvet alanlarının docking açısından önemli bazı fiziksel bileşenleri derin öğrenme modellerinde doğrudan bulunmayabilmektedir.⁴ Bu nedenle yapay zekâ tarafından oluşturulan bir yapının fizik tabanlı minimizasyon veya arıtma aşamasından geçirilmesi, özellikle sterik çakışmalar ve bağ geometrileri açısından yararlı olabilmektedir.

Bu sonuçlar, AlphaFold 3 ve benzeri modellerin yalnızca geometrik doğrulukla değerlendirilmesinin yeterli olmayabileceğini göstermektedir. Yapısal doğruluk, kimyasal geçerlilik ve genelleme performansı birbirinden ayrı değerlendirme boyutları olarak ele alınmalıdır.

3.2. DiffDock, NeuralPLexer ve Esnek Docking

Protein-ligand docking probleminin derin öğrenme ile yeniden formüle edilmesinde DiffDock önemli bir aşama oluşturmuştur. DiffDock, ligandın bağlanma pozunun difüzyon süreci üzerinden örneklenmesini ve ligandın translasyon, rotasyon ve burulma derecelerinin birlikte ele alınmasını sağlamıştır.¹⁶ Bu yaklaşım, geleneksel arama ve puanlama yöntemlerinden farklı olarak ligand konformasyonlarının üretici bir süreç içerisinde oluşturulmasına olanak sağlamıştır.

NeuralPLexer ise protein sekansı ve ligand moleküler grafiğinden protein-ligand kompleks yapılarının doğrudan tahmin edilmesine yönelik geliştirilmiştir.⁹ Özellikle ligand bağlanmasıyla ilişkili konformasyonel değişimlerin önemli olduğu durumlarda, ligandsız ve ligand-bağlı yapı durumlarının birlikte örneklenmesi amaçlanmıştır.

Bu yöntemler, docking probleminin yalnızca ligandın sabit bir protein cebine yerleştirilmesi olarak ele alınmasının yetersiz kalabileceğini göstermektedir. Protein-ligand etkileşimi karşılıklı bir uyum süreci olarak değerlendirildiğinde, protein ve ligandın serbestlik derecelerinin birlikte ele alınması öenmli bir yaklaım olarak ortaya çıkmaktadır.

3.3. Protein Konformasyonel Ansambllerinin Modellenmesi

Proteinlerin biyolojik fonksiyonları çoğu zaman tek bir yapı ile sınırlı değildir. Konformasyonel ansambllerin belirlenmesi, ligand bağlanması, kataliz, allosteri ve protein-protein etkileşimlerinin açıklanmasında önemli bir rol oynamaktadır.⁶

AlphaFold ve ESMFold gibi yüksek doğruluklu tek durumlu yapı tahmin modellerinin önemli başarısına rağmen, tek bir tahminin termodinamik olarak erişilebilir tüm konformasyonları temsil etmesi beklenmemektedir. AlphaFlow yaklaşımında bu problem akış eşleştirme kullanılarak ele alınmış ve AlphaFold ile ESMFold gibi modeller, dizi-koşullu üretici konformasyon modellerine dönüştürülmüştür.⁷

AlphaFlow ve ESMFlow ile elde edilen sonuçlarda, Protein Data Bank (PDB) yapıları üzerinde doğruluk ile konformasyonel çeşitlilik arasında daha dengeli bir performans elde edildiği bildirilmiştir.⁷ Tüm atom moleküler dinamik simülasyonlarından elde edilen ansambllerle yapılan eğitim sonrasında ise görülmemiş proteinlerde konformasyonel esnekliğin ve daha yüksek dereceli ansambl özelliklerinin yakalanabildiği rapor edilmiştir.⁷

Bu yaklaşımın en önemli sonucu, yapay zekâ temelli yapı üretiminin yalnızca tek bir “en iyi” yapı üretme problemi olmaktan çıkarılarak, belirli bir proteinin erişebileceği konformasyonel alanın yaklaşık olarak örneklenmesi problemine dönüştürülmesidir. Bununla birlikte, bir üretici modelin deneysel veya moleküler dinamik ansamblini istatistiksel olarak yeniden üretmesi ile gerçek termodinamik serbest enerji yüzeyini doğru biçimde temsil etmesi aynı şey değildir. Bu ayrım, gelecekteki çalışmalar açısından özellikle önem taşımaktadır.

3.4. Dinamik Docking ve DynamicBind

AlphaFold tarafından tahmin edilen apo protein yapılarının ligand docking için doğrudan kullanılması, ligand bağlanması sırasında ortaya çıkan protein yeniden düzenlenmelerinin göz ardı edilmesine neden olabilmektedir.¹⁷ Özellikle yan zincir rotamerlerinin değişmesi veya bağlanma cebinin genişlemesi gibi yerel değişimler, apo ve holo yapılar arasında önemli farklara yol açabilmektedir.

DynamicBind bu probleme eş değişken geometrik difüzyon yaklaşımıyla yanıt vermektedir.¹⁷ Modelde protein konformasyonunun ligandın varlığına bağlı olarak değiştirilmesi ve ligand-özgül yapıların doğrudan üretilmesi hedeflenmektedir.

DynamicBind’in önemli özelliklerinden biri, ligand bağlanmasına bağlı protein yeniden düzenlenmesinin docking işleminin dışında ayrı bir adım olarak değil, doğrudan tahmin sürecinin parçası olarak ele alınmasıdır.¹⁷ Bu yaklaşım özellikle bağlanma cebinin apo durumda kapalı olduğu veya ligand varlığında belirgin biçimde yeniden düzenlendiği sistemlerde geleneksel rijit docking paradigmasına göre farklı bir çözüm sunmaktadır.

DynamicBind ile SETD2 üzerinde gerçekleştirilen örnek çalışma, EZM0414 ligandının eğitim yapılarında görülmeyen bir kriptik bağlanma cebine yerleşiminin doğruya yakın biçimde tahmin edilebildiğini göstermiştir.¹⁷ Bununla birlikte tek bir başarılı vaka, yöntemin kriptik cep problemini genel olarak çözdüğünü göstermemektedir. Bu tür sonuçların daha geniş ve düşük homolojili kıstaslarda değerlendirilmesi gerekmektedir.

3.5. Kriptik Cepler ve Konformasyonel Seçicilik

Kriptik bağlanma cepleri, apo protein yapısında belirgin olmayan ancak ligand bağlanması veya konformasyonel değişim sonrasında erişilebilir hâle gelen bölgeler olarak tanımlanmaktadır. Bu bölgeler, daha önce bilinen aktif bölgeler dışında yeni bağlanma alanları sunabildikleri için ilaç keşfi açısından özel önem taşımaktadır.¹⁸

AlphaFold tahminlerinin kriptik cep keşfinde kullanılmasına yönelik çalışmalar, tek bir statik yapıdan ziyade farklı konformasyonların örneklenmesinin daha yararlı olabileceğini göstermiştir.¹⁹ Bu durum, AlphaFold benzeri modellerin kriptik cepler açısından doğrudan “cep keşif motoru” olmaktan ziyade konformasyonel örnekleme araçlarıyla birlikte kullanılabileceğini düşündürmektedir.

AlphaFold2-RAVE yaklaşımında ise dizi bilgisinden başlayarak Boltzmann sıralamasına ulaşan bir protokol oluşturulmuş ve apo yapıların biyolojik olarak anlamlı metastabil durumlara erişiminin araştırılması hedeflenmiştir.²⁰ Böylece yapı tahmini ile fiziksel enerji manzarasının örneklenmesi arasında bir köprü kurulmaya çalışılmıştır.

Kriptik bağlanma bölgelerinin hesaplamalı olarak belirlenmesine ilişkin güncel çalışmalar, moleküler dinamik ve makine öğrenmesi yaklaşımlarının birbirini tamamlayabileceğini göstermektedir.¹⁸˒²¹ Moleküler dinamik yöntemleri fiziksel hareketlerin simülasyonunu sağlarken hesaplama maliyeti yüksek olabilmekte; makine öğrenmesi yöntemleri daha hızlı örnekleme sağlayabilmekle birlikte eğitim dağılımına bağımlılık ve fiziksel tutarlılık sorunları yaşayabilmektedir.

Bu nedenle kriptik cep keşfinde yapay zekâ ve moleküler dinamik yaklaşımlarının birbirini tamamladığı hibrit çerçeveler önemli bir araştırma yönü olarak öne çıkmaktadır. Yakın tarihli değerlendirmeler de fizik tabanlı simülasyonların ve yapay zekâ yöntemlerinin birlikte kullanılmasının kriptik cep probleminin çözümünde önemli bir yön oluşturduğunu ortaya koymaktadır.²²

4. Uygulama-Özgül Sistemlerde AlphaFold 3 ve Dinamik Yapı Tahmini

4.1. G-Protein Bağlı Reseptörler

G-protein bağlı reseptörler (GPCR’ler), hücre dışı sinyallerin hücre içi yanıtlarla ilişkilendirilmesinde görev alan ve ilaç keşfinde yoğun olarak hedeflenen membran proteinleridir. GPCR’lerin ligand türleri, aktivasyon durumları ve konformasyonel geçişleri bakımından yüksek çeşitlilik göstermesi, yapı tahminini özellikle zorlaştırmaktadır.

AlphaFold 2’nin GPCR yapıları üzerindeki değerlendirmelerinde genel reseptör mimarisinin çoğu durumda başarılı biçimde yakalanabildiği, ancak ligand-özgül ayrıntıların daha değişken olduğu gösterilmiştir.²³ Bu sınırlılığın AlphaFold 3 ile tamamen ortadan kalkmadığı görülmektedir.

AlphaFold 3 ile deneysel ligand-bağlı GPCR yapılarının karşılaştırıldığı değerlendirmede, genel reseptör mimarisinde AlphaFold 2’ye kıyasla iyileşme görülmesine karşın iyon, peptit ve protein ligandlarının bağlanma pozlarında önemli farklılıkların devam ettiği bildirilmiştir.²⁴ Bu sonuç, küresel reseptör yapısının doğru tahmin edilmesi ile ligandın atomik bağlanma geometrisinin doğru tahmin edilmesinin birbirinden ayrılması gerektiğini göstermektedir.

Daha önemlisi, 2025 yılında gerçekleştirilen güncel değerlendirmede 74 AlphaFold 3 tahmini deneysel küçük molekül-GPCR kompleksiyle karşılaştırılmış ve global reseptör mimarisinin ve ortosterik ceplerin genel olarak iyi yakalanmasına rağmen ligand konumlandırmasının özellikle allosterik modülatörlerde değişken ve sıklıkla hatalı olduğu gösterilmiştir.²⁵ Bu sonuç, AlphaFold 3’ün GPCR yapısının ilk hipotezini oluşturmak açısından yararlı olabileceğini, ancak yüksek hassasiyetli ligand tasarımı için deneysel doğrulamanın hâlen önemli olduğunu göstermektedir.

GPCR yapılarının belirlenmesinde kriyo-elektron mikroskopisinin yaygınlaşması da bu bağlamda önem taşımaktadır. Kriyo-EM, farklı ligand ve sinyal proteinleriyle kompleks hâlde bulunan GPCR’lerin yüksek çözünürlüklü yapılarının belirlenmesine önemli katkılar sağlamıştır.²⁶ Dolayısıyla hesaplamalı tahminlerin deneysel yapıların alternatifi olarak değil, deneysel yapılarla birlikte çalışan bir hipotez üretim bileşeni olarak değerlendirilmesi daha uygun görünmektedir.

4.2. Antikor-Antijen Kompleksleri

Antikor-antijen komplekslerinin doğru tahmini, antikor mühendisliği, terapötik geliştirme ve aşı tasarımı açısından önem taşımaktadır. Bununla birlikte antikorların tamamlayıcılık belirleyici bölgeleri (CDR), özellikle CDR-H3, yüksek konformasyonel çeşitlilik gösterebildiği için genel protein yapı tahmin yöntemleri açısından zorlayıcıdır.

AlphaFold 3’ün antikor ve nanobody docking performansının incelendiği bir değerlendirmede, tek tohum kullanıldığında yüksek doğruluklu docking başarı oranlarının antikorlar için %10,2, nanobody’ler için %13,3 düzeyinde kaldığı bildirilmiştir.²⁷ Yirmi örnekleme tohumu kullanılmasıyla CDR-H3 doğruluğunda belirgin iyileşme sağlanabilmesine rağmen, tek tohum koşulundaki yüksek başarısızlık oranı modelin örnekleme stratejisine duyarlılığını göstermektedir.²⁷

Bu bulgu, biyolojik kompleks tahmininde yalnızca model mimarisinin değil, örnekleme sayısının ve tahminlerin sıralanma yönteminin de önemli olduğunu göstermektedir.

FoldBench gibi düşük homolojili ve çok görevli kıstasların geliştirilmesi, antikor-antijen sistemlerinin daha gerçekçi koşullarda karşılaştırılmasına katkı sağlamıştır.²⁸ Antikor-antijen komplekslerinde mevcut modellerin yüksek başarısızlık oranlarının devam etmesi, özellikle yeni antikor dizileri ve uzun CDR bölgelerinde konformasyonel esnekliğin daha iyi modellenmesi gerektiğini göstermektedir.²⁸

Bağlanmamış antikor yapılarını değerlendiren güncel derlemeler de CDR bölgelerinin esnekliğinin ve antijen bağlanması öncesindeki konformasyonel çeşitliliğin önemli bir problem olmaya devam ettiğini göstermektedir.²⁹ Dolayısıyla antikor docking probleminin yalnızca iki rijit yapının eşleştirilmesi şeklinde ele alınması yeterli görünmemektedir.

4.3. PROTAC Ternary Kompleksleri

Hedeflenmiş protein degradasyonu, özellikle proteoliz hedefleyen kimeralar (PROTAC’lar) aracılığıyla proteinlerin hücre içindeki doğal yıkım mekanizmalarına yönlendirilmesini amaçlayan bir yaklaşım olarak geliştirilmiştir. PROTAC sistemlerinde küçük molekül degrader, hedef protein ve E3 ubiquitin ligaz arasında üçlü bir kompleks (Ternary kompleks) oluşturulmaktadır.

Bu sistemlerde ternary kompleksin geometrisi yalnızca bağlanma afinitesini değil, protein-protein arayüzünü, linker konformasyonunu ve ubiquitinasyon için uygun geometrinin oluşmasını da etkileyebilmektedir. Bu nedenle PROTAC yapılarının tahmini, standart protein-ligand docking probleminden daha karmaşık bir yapı göstermektedir.

AlphaFold 3 ile PRosettaC’nin 36 kristalografik olarak çözülmüş ternary kompleks üzerinde karşılaştırıldığı çalışma, bu problemin önemli sınırlılıklar taşıdığını göstermiştir.³⁰ Özellikle AlphaFold 3 tahminlerinin bazı durumlarda yardımcı proteinlerin toplam arayüz alanını artırması nedeniyle genel DockQ skorlarının yükseldiği, ancak degrader’ a özgü bağlanmanın aynı ölçüde doğru temsil edilmeyebildiği bildirilmiştir.³¹

Bu sonuç, çok bileşenli komplekslerde global arayüz doğruluğu ile biyolojik olarak kritik küçük molekül-linker geometrisinin birbirinden ayrılması gerektiğini göstermektedir. PROTAC tasarımında yalnızca protein-protein arayüzünün doğru olması yeterli olmayabileceğinden, linker örneklemesi, kimyasal ankraj noktaları ve protein esnekliği birlikte ele alınmalıdır.

4.4. Fosforilasyon, Esneklik ve Deneysel Verilerin Entegrasyonu

Proteinlerin fonksiyonları yalnızca amino asit dizisi tarafından belirlenmemekte, translasyon sonrası modifikasyonlar da konformasyonel durumların dağılımını etkileyebilmektedir. Fosforilasyonun AlphaFold 3 tarafından üretilen modellerle ilişkisini inceleyen çalışmalar, bu tür modifikasyonların oluşturduğu ince ölçekli konformasyonel değişimlerin tek bir yapı tahminiyle güvenilir biçimde temsil edilmesinin hâlen zor olduğunu göstermektedir.³²

Protein esnekliğinin tahmininde yalnızca statik atomik yapıların değil, kriyo-EM yoğunluk haritalarının da kullanılması alternatif bir yol sunmaktadır. Atomik yapı bilgisi ile deneysel kriyo-EM yoğunluk verisinin bütünleştirildiği derin öğrenme yaklaşımında protein yapısal esnekliğinin daha ayrıntılı biçimde tahmin edilebildiği bildirilmiştir.³³

Bu tür çalışmalar, gelecekte yapı tahmin modellerinin yalnızca “yapı üretmek” yerine deneysel veriler tarafından kısıtlanan konformasyonel dağılımları üretmesinin daha önemli hâle gelebileceğini göstermektedir.

Protein esnekliğinin moleküler dinamik simülasyonlarından türetilmiş bilgilerini sistematik biçimde sunan ATLAS veri tabanı da bu yönde önemli bir kaynak oluşturmaktadır.³⁴ Böyle veri kaynaklarının artırılması, üretici modellerin yalnızca kristal yapılarını değil, biyolojik olarak erişilebilir hareketleri öğrenebilmesine katkıda bulunabilir.

5. İlaç Keşfi, Yeni Nesil Modeller ve Gelecek Perspektifi

5.1. Yapay Zekâ ve Fizik Tabanlı Yaklaşımların Birleştirilmesi

AlphaFold 3 ve benzeri modellerin ilaç keşfindeki en önemli potansiyellerinden biri, deneysel yapısı bulunmayan hedefler için yapısal hipotezlerin hızlı biçimde oluşturulabilmesidir. Bununla birlikte, tahmin edilen yapının ilaç keşfi sürecinin tamamında güvenilir bir deneysel gerçeklik olarak kabul edilmesi uygun değildir.

AlphaFold kullanılarak deneysel yapısı bulunmayan bir hedef olan CDK20 için küçük molekül keşfine yönelik uçtan uca bir yapay zekâ iş akışı uygulanmış ve ilk isabet molekülünün belirlenmesi için yedi bileşiğin sentezlendiği ve hedefin seçilmesinden itibaren 30 gün içinde bağlanma gösteren bir molekülün elde edildiği rapor edilmiştir.³⁵ Bu çalışma, AlphaFold modellerinin doğrudan ilaç keşfi sürecine entegre edilebileceğini gösteren erken örneklerden biridir.

Ancak bu tür örneklerin tek başına yapısal tahminin ilaç keşfindeki genel başarı oranını temsil ettiği düşünülmemelidir. İlaç keşfi; hedef seçimi, ligand üretimi, docking, sanal tarama, sentez, biyokimyasal doğrulama ve optimizasyon gibi birbirine bağlı çok sayıda aşamadan oluşmaktadır.

AlphaFold 3’ün ilaç keşfi uygulamalarını değerlendiren kapsamlı incelemelerde, modelin özellikle protein konformasyonunun fazla değişmediği ikili protein-ligand sistemlerinde yararlı olabildiği, ancak apo-holo farklılığının büyük olduğu sistemlerde ve afinite tahmini gibi nicel görevlerde daha değişken sonuçlar verdiği bildirilmiştir.³⁶

Bu nedenle yapı tahmini, fizik tabanlı arıtma ve deneysel doğrulamanın birlikte kullanıldığı hibrit iş akışları, hesaplamalı tahminlerin fiziksel ve deneysel kısıtlarla birlikte değerlendirilmesine olanak sağlamaktadır. Protein-protein docking alanındaki çalışmalar da AlphaFold tarafından oluşturulan yapıların fizik tabanlı Replica Exchange docking ile birleştirilmesinin, özellikle başarısız AlphaFold tahminlerinin iyileştirilmesinde yararlı olabileceğini göstermiştir.³⁷

Bu hibrit yaklaşımın temel avantajı, yapay zekânın hızlı örnekleme kapasitesinin fizik tabanlı yöntemlerin enerji ve geometri kısıtlarıyla birleştirilmesidir. Yapay zekâ tarafından üretilen geniş bir yapı havuzu, fiziksel arıtma ve enerji tabanlı filtreleme ile daraltılabilir; ardından deneysel biyofiziksel ölçümlerle en olası modeller test edilebilir.

5.2. Bağlanma Afinitesi ve Yapısal Doğruluk Arasındaki Ayrım

Protein-ligand kompleksinin doğru geometrisinin tahmin edilmesi ile ligandın bağlanma afinitesinin doğru tahmin edilmesi birbirinden farklı problemlerdir. Bir ligand doğru bağlanma cebine yerleşse bile bağlanma serbest enerjisinin doğru hesaplanması; çözücü etkileri, entropik katkılar, protonasyon durumları, su aracılı etkileşimler ve protein konformasyonel değişimleri gibi çok sayıda değişkenin hesaba katılmasını gerektirmektedir.

Bu nedenle AlphaFold 3’ün yüksek kompleks yapı doğruluğunun otomatik olarak yüksek afinite tahmin doğruluğu anlamına gelmediği vurgulanmalıdır. Boltz-2 gibi yeni modellerde yapı tahminine ek olarak bağlanma afinitesini tahmin etmeye yönelik özel bileşenlerin geliştirilmesi, bu iki problemin tek modelleme çerçevesinde birleştirilmesine yönelik önemli bir yönelimdir.¹⁴

Bununla birlikte afinite tahmininin güvenilirliği için deneysel bağlanma verilerinin, uygun negatif örneklerin ve veri sızıntısının kontrol edildiği düşük benzerlikli kıstasların kullanılması gerekmektedir. Aksi durumda model, kimyasal benzerlik veya eğitim veri setindeki tekrarlar üzerinden yüksek performans gösteriyor gibi görünebilir.

Bu problem, AlphaFold 3 ve diğer all-atom modellerin değerlendirilmesinde eğitim verisine benzerliğin kritik bir değişken olduğunu gösteren FoldBench sonuçlarıyla da uyumludur.⁵

5.3. RNA ve Protein Dışı  Biyomoleküler Hedefler 

AlphaFold 3’ün kapsamı yalnızca protein-ligand sistemleriyle sınırlı değildir. Modelin RNA ve DNA gibi nükleik asitleri kompleks tahmininin parçası olarak ele alabilmesi, yapı temelli ilaç keşfi açısından protein dışı biyomoleküler hedeflerin yapı temelli olarak incelenmesi için kapsamı genişletmektedir.³

RNA üç boyutlu yapı tahmini uzun süre zor bir problem olarak kalmış ve RNA’nın yüksek konformasyonel esnekliği, baz çiftlenmesi ve uzun menzilli etkileşimleri bu zorluğun temel bileşenlerini oluşturmuştur. trRosettaRNA ile transformer tabanlı geometrik tahmin ve enerji minimizasyonunun birleştirilmesiyle RNA 3B yapı tahmininde önemli performans kazanımları elde edilmiş ve CASP15 ile RNA-Puzzles gibi kör değerlendirmelerde rekabetçi sonuçlar bildirilmiştir.³⁸

Bu gelişmeler, protein merkezli yapı tahmininin ötesine geçilerek farklı biyomoleküler sınıfların aynı hesaplamalı çerçevede ele alınabileceğini göstermektedir. Ancak RNA-ligand ve RNA-protein komplekslerinde de konformasyonel heterojenlik, iyon bağımlılığı ve solvent etkileri gibi problemler devam etmektedir.

Dolayısıyla AlphaFold 3’ün geniş moleküler kapsamı önemli bir avantaj sağlamakla birlikte, farklı moleküler sınıflar arasında aynı doğruluk düzeyinin varsayılması uygun değildir.

5.4. Yapısal Biyoinformatikte Yeni Nesil Yaklaşımlar

AlphaFold 3 sonrası dönemde yalnızca kompleks tahmini değil, protein yapısının farklı ölçeklerde modellenmesine yönelik yeni yöntemler de geliştirilmiştir. D-I-TASSER gibi derin öğrenme tabanlı yaklaşımlar, tek domain ve çok domain proteinlerin yapı tahminini geliştirmeyi hedeflemiş ve protein yapı tahmini alanındaki alternatif metodolojik çizgilerin devam ettiğini göstermiştir.³⁹

Benzer biçimde, protein-protein docking alanında AlphaFold, Rosetta ve Replica Exchange yöntemlerinin birleştirilmesi, veri temelli tahmin ile fiziksel örneklemenin birbirini tamamlayabileceğini ortaya koymaktadır.³⁷

Bu yaklaşımın daha geniş bir çerçevede değerlendirilmesiyle, geleceğin yapısal biyoinformatik sistemlerinin tek bir modelden ziyade çok aşamalı hesaplama platformları hâline gelmesi beklenebilir. Böyle bir platformda ilk aşamada yüksek hızlı üretici modeller geniş bir yapı uzayı oluşturabilir; ikinci aşamada fizik tabanlı yöntemler geometrik ve enerjetik filtreleme gerçekleştirebilir; üçüncü aşamada deneysel verilerle model sıralaması yapılabilir ve son aşamada fonksiyonel deneyler aracılığıyla biyolojik doğrulama sağlanabilir.

5.5. Mevcut Metodolojik Boşluklar

Mevcut literatür birkaç temel boşluğun devam ettiğini göstermektedir. İlk olarak, yeni protein ailelerine ve yeni ligand kimyasına genelleme problemi çözülmüş değildir.⁵˒¹⁰ Özellikle ligand benzerliği azaldıkça tahmin doğruluğundaki düşüş, eğitim veri dağılımının önemli bir belirleyici olmaya devam ettiğini göstermektedir.

İkinci olarak, fiziksel geçerlilik problemi devam etmektedir.⁴ RMSD veya DockQ gibi yapısal ölçütlerin yanında stereokimyasal, geometrik ve enerjetik doğrulama gerekmektedir.

Üçüncü olarak, protein dinamiklerinin temsil edilmesi hâlâ sınırlıdır. AlphaFlow gibi yöntemler konformasyonel ansambllerin üretimini mümkün kılmakta olsa da, üretilen ansambllerin gerçek biyolojik serbest enerji yüzeyini ne ölçüde temsil ettiği daha kapsamlı deneysel doğrulamalar gerektirmektedir.⁷

Dördüncü olarak, ligand bağlanmasıyla ortaya çıkan indüklenmiş uyum ve kriptik ceplerin tahmini hâlen zordur. DynamicBind gibi yöntemler bu probleme önemli bir yaklaşım sunmakta ancak geniş kapsamlı ve düşük homolojili kıstaslarda genelleme sorunu devam etmektedir.⁸˒¹⁷

Beşinci olarak, bağlanma afinitesi ile yapı doğruluğu arasındaki ilişkinin doğrudan olmadığı görülmektedir.¹⁴ Bu nedenle gelecekte yapı tahmini ve afinite tahmininin ayrı fakat birbirini destekleyen görevler olarak değerlendirilmesi gerekmektedir.

Altıncı olarak, çok bileşenli sistemlerde global yapı doğruluğu ile biyolojik işlev açısından kritik yerel geometrinin birbirinden ayrılması gerekmektedir. PROTAC ternary kompleksleri bu sorunun belirgin örneklerinden birini oluşturmaktadır.³⁰˒³¹

Son olarak, deneysel verilerin hesaplamalı modellerle daha doğrudan bütünleştirilmesi gerekmektedir. Kriyo-EM yoğunlukları, moleküler dinamik ansamblleri, biyofiziksel bağlanma ölçümleri ve fonksiyonel deneylerden elde edilen verilerin model eğitiminde veya tahmin sıralamasında kullanılması, yalnızca PDB statik yapıları üzerinden öğrenmeye kıyasla daha biyolojik olarak anlamlı modellerin geliştirilmesine katkı sağlayabilir.³³˒³⁴

6. Sonuç

AlphaFold 3, protein yapı tahmininin tek protein yapısından proteinler, nükleik asitler, küçük moleküller, iyonlar ve modifiye kalıntılar içeren çok bileşenli biyomoleküler komplekslere doğru genişlemesini sağlayan önemli bir metodolojik gelişme oluşturmuştur.³ Bununla birlikte, bağımsız kıstas çalışmalarının sonuçları, yüksek statik kompleks doğruluğunun tüm biyomoleküler sistemlerde aynı düzeyde genellenemediğini göstermektedir.⁵ Özellikle yeni ligand kimyası, büyük apo-holo konformasyonel farklılıklar, antikor-antijen etkileşimleri, GPCR-ligand kompleksleri ve allosterik bağlanma gibi problemler hâlen önemli zorluklar taşımaktadır.²⁵˒²⁷˒²⁸

PoseBusters ile ortaya konan fiziksel geçerlilik sorunu, yapısal tahminlerin yalnızca RMSD veya benzeri geometrik ölçütlerle değerlendirilmemesi gerektiğini göstermiştir.⁴ Kimyasal geometri, stereokimya, sterik uygunluk ve fiziksel enerji özelliklerinin değerlendirmeye dahil edilmesi gerekmektedir.

AlphaFlow, DynamicBind ve NeuralPLexer gibi yeni nesil üretici yöntemler, bu sınırlılıkların önemli bir bölümünün protein dinamikleri ve ligand-özgül konformasyonlar üzerinden ele alınabileceğini göstermektedir.⁷˒⁹˒¹⁷ Bununla birlikte bu modellerin moleküler dinamik simülasyonlarının veya deneysel yapı belirleme yöntemlerinin tamamen yerine geçmesi yerine, daha geniş yapı uzaylarının hızlı biçimde örneklenmesini sağlayan tamamlayıcı araçlar olarak değerlendirilmesi daha uygun görünmektedir.

GPCR, antikor-antijen ve PROTAC sistemlerinde elde edilen sonuçlar, biyolojik bağlamın tahmin doğruluğu açısından belirleyici olduğunu göstermektedir.²⁵˒²⁷˒³⁰ Bu nedenle gelecekte tek bir genel amaçlı modelin tüm biyomoleküler problemleri aynı doğrulukta çözmesi yerine, genel amaçlı modellerin hedefe özgü fiziksel ve deneysel yöntemlerle birleştirildiği hibrit iş akışlarının daha fazla önem kazanması beklenmektedir.

Sonuç olarak, AlphaFold 3 ve sonrasında geliştirilen açık kaynaklı modeller, yapı temelli biyolojik araştırmaların kapsamını önemli ölçüde genişletmiştir. Ancak mevcut literatür, yapısal tahmin ile biyolojik gerçekliğin aynı kavramlar olmadığını da açık biçimde göstermektedir. Gelecekteki ilerlemenin; daha iyi konformasyonel örnekleme, yeni kimyasal uzaylara genelleme, fiziksel geçerlilik, bağlanma afinitesi, kriptik cep keşfi ve deneysel veri entegrasyonunun aynı modelleme çerçevesinde birleştirilmesine bağlı olması beklenmektedir.

DERLEYEN: Hazel Birgül

EDİTÖR: Beray Kalelioğlu

Kaynakça

1. Jumper, J., Evans, R., Pritzel, A., Green, T., Figurnov, M., Ronneberger, O., Tunyasuvunakool, K., Bates, R., Žídek, A., Potapenko, A., et al. (2021). Highly accurate protein structure prediction with AlphaFold. Nature, 596(7873), 583–589. https://doi.org/10.1038/s41586-021-03819-2
2. Tunyasuvunakool, K., Kozlovskii, S., et al. (2021). Highly accurate protein structure prediction for the human proteome. Nature, 596, 590–596. https://doi.org/10.1038/s41586-021-03828-1
3. Abramson, J., Adler, J., Dunger, J., Evans, R., Green, T., Pritzel, A., Ronneberger, O., Willmore, L., Ballard, A. J., Bambrick, J., et al. (2024). Accurate structure prediction of biomolecular interactions with AlphaFold 3. Nature, 630(8016), 493–500. https://doi.org/10.1038/s41586-024-07487-w
4. Buttenschoen, M., Morris, G. M., & Deane, C. M. (2024). PoseBusters: AI-based docking methods fail to generate physically valid poses or generalise to novel sequences. Chemical Science, 15(9), 3130–3139. https://doi.org/10.1039/D3SC04185A
5. Xu, S., Feng, Q., Qiao, L., Wu, H., Shen, T., Cheng, Y., Zheng, S., & Sun, S. (2025). FoldBench: An all-atom benchmark for biomolecular structure prediction. Nature Communications. https://doi.org/10.1038/s41467-025-67127-3
6. Bonomi, M., Heller, G. T., Camilloni, C., & Vendruscolo, M. (2017). Principles of protein structural ensemble determination. Current Opinion in Structural Biology, 42, 106–116. https://doi.org/10.1016/j.sbi.2016.12.004
7. Jing, B., Berger, B., & Jaakkola, T. (2024). AlphaFold meets flow matching for generating protein ensembles. arXiv. https://doi.org/10.48550/arXiv.2402.04845
8. Morehead, A., Giri, N., Liu, J., Neupane, P., & Cheng, J. (2025). Assessing the potential of deep learning for protein–ligand docking. Nature Machine Intelligence. https://doi.org/10.1038/s42256-025-01160-1
9. Qiao, Z., Nie, W., Vahdat, A., Miller, T. F., III, & Anandkumar, A. (2024). State-specific protein–ligand complex structure prediction with a multiscale deep generative model. Nature Machine Intelligence, 6, 195–208. https://doi.org/10.1038/s42256-024-00792-z
10. Corso, G., Deng, A., Fry, B., Polizzi, N., Barzilay, R., & Jaakkola, T. (2024). Deep confident steps to new pockets: Strategies for docking generalization. arXiv. https://arxiv.org/abs/2402.18396
11. Krishna, R., Wang, J., Ahern, W., Sturmfels, P., Venkatesh, P., Kalvet, I., Lee, G. R., et al. (2024). Generalized biomolecular modeling and design with RoseTTAFold All-Atom. Science, 384(6693), eadl2528. https://doi.org/10.1126/science.adl2528
12. Chai Discovery, Boitreaud, J., Dent, J., McPartlon, M., Meier, J., Reis, V., Rogozhnikov, A., & Wu, K. (2024). Chai-1: Decoding the molecular interactions of life. bioRxiv. https://doi.org/10.1101/2024.10.10.615955
13. Wohlwend, J., Corso, G., Passaro, S., Getz, N., Reveiz, M., Leidal, K., et al. (2024). Boltz-1: Democratizing biomolecular interaction modeling. bioRxiv. https://doi.org/10.1101/2024.11.19.624167
14. Passaro, S., Corso, G., Wohlwend, J., Reveiz, M., Thaler, S., Somnath, V. R., et al. (2025). Boltz-2: Towards accurate and efficient binding affinity prediction. bioRxiv. https://doi.org/10.1101/2025.06.14.659707
15. Chen, X., Zhang, Y., Lu, C., Ma, W., Guan, J., Gong, C., Yang, J., et al. (2025). Protenix: Advancing structure prediction through a comprehensive AlphaFold3 reproduction. bioRxiv. https://doi.org/10.1101/2025.01.08.631967
16. Corso, G., Stärk, H., Jing, B., Barzilay, R., & Jaakkola, T. (2022). DiffDock: Diffusion steps, twists, and turns for molecular docking. arXiv. https://doi.org/10.48550/arXiv.2210.01776
17. Lu, W., Zhang, J., Huang, W., Zhang, Z., Jia, X., Wang, Z., Shi, L., Li, C., Wolynes, P. G., & Zheng, S. (2024). DynamicBind: Predicting ligand-specific protein-ligand complex structure with a deep equivariant generative model. Nature Communications, 15, 1071. https://doi.org/10.1038/s41467-024-45461-2
18. Gašparíková, D., Chikhale, R., Cole, J., & Pohl, E. (2025). Recent computational advances in the identification of cryptic binding sites for drug discovery. Bioinformatics Advances, 5(1), vbaf156. https://doi.org/10.1093/bioadv/vbaf156
19. Meller, A., Bhakat, S., Solieva, S., & Bowman, G. R. (2023). Accelerating cryptic pocket discovery using AlphaFold. Journal of Chemical Theory and Computation, 19(14), 4355–4363.
20. Vani, B. P., Aranganathan, A., Wang, D., & Tiwary, P. (2023). AlphaFold2-RAVE: From sequence to Boltzmann ranking. Journal of Chemical Theory and Computation, 19(13), 4351–4354.
21. Lee, J., Nguyen, C. H., & Mamitsuka, H. (2025). Beyond rigid docking: Deep learning approaches for fully flexible protein-ligand interactions. Briefings in Bioinformatics, 26(5), bbaf454. https://doi.org/10.1093/bib/bbaf454
22. Bowman, G. R. (2026). Decrypting cryptic pockets with physics-based simulations and artificial intelligence. Current Opinion in Structural Biology, 96, 103215. https://doi.org/10.1016/j.sbi.2025.103215
23. He, X.-H., You, C.-Z., Jiang, H.-L., Jiang, Y., Xu, H. E., & Cheng, X. (2023). AlphaFold2 versus experimental structures: Evaluation on G protein-coupled receptors. Acta Pharmacologica Sinica, 44(1), 1–7. https://doi.org/10.1038/s41401-022-00938-y
24. He, X.-H., Li, J.-R., Shen, S.-Y., & Xu, H. E. (2025). AlphaFold3 versus experimental structures: Assessment of the accuracy in ligand-bound G protein-coupled receptors. Acta Pharmacologica Sinica, 46(4), 1111–1122. https://doi.org/10.1038/s41401-024-01429-y
25. Shen, S.-Y., Li, J.-R., Wang, Y.-S., Li, S.-N., Xu, H. E., & He, X.-H. (2025). An update for AlphaFold3 versus experimental structures: Assessing the precision of small molecule binding in GPCRs. Acta Pharmacologica Sinica, 46(12), 3355–3364. https://doi.org/10.1038/s41401-025-01617-4
26. Duan, J., He, X.-H., Li, S.-J., & Xu, H. E. (2024). Cryo-electron microscopy for GPCR research and drug discovery in endocrinology and metabolism. Nature Reviews Endocrinology, 20, 349–365. https://doi.org/10.1038/s41574-024-00957-1
27. Hitawala, F. N., & Gray, J. J. (2025). What does AlphaFold3 learn about antibody and nanobody docking, and what remains unsolved? mAbs. https://doi.org/10.1080/19420862.2025.2545601
28. Xu, S., Feng, Q., Qiao, L., Wu, H., Shen, T., Cheng, Y., Zheng, S., & Sun, S. (2025). FoldBench: An all-atom benchmark for biomolecular structure prediction. Nature Communications. https://doi.org/10.1038/s41467-025-67127-3
29. Greenshields-Watson, A., Vavourakis, O., Spoendlin, F. C., Cagiada, M., & Deane, C. M. (2025). Challenges and compromises: Predicting unbound antibody structures with deep learning. Current Opinion in Structural Biology, 90, 102983. https://doi.org/10.1016/j.sbi.2025.102983
30. Schulz, J. M., Schürer, S. I., Reynolds, R. C., & Schürer, S. C. (2025). Benchmarking the builders: A comparative analysis of PRosettaC and AlphaFold3 for predicting PROTAC ternary complexes. Research Square. https://doi.org/10.21203/rs.3.rs-6866610/v1
31. Schulz, J. M., Schürer, S. I., Reynolds, R. C., & Schürer, S. C. (2025). PRosettaC outperforms AlphaFold3 for modeling PROTAC ternary complexes. Scientific Reports.
32. Ramasamy, P., Zuallaert, J., Martens, L., & Vranken, W. F. (2025). Assessing the relation between protein phosphorylation, AlphaFold3 models and conformational variability. bioRxiv.
33. Song, X., Bao, L., Feng, C., et al. (2024). Accurate prediction of protein structural flexibility by deep learning integrating intricate atomic structures and cryo-EM density information. Nature Communications, 15, 5538. https://doi.org/10.1038/s41467-024-49858-x
34. Vander Meersche, Y., Cretin, G., Gheeraert, A., et al. (2024). ATLAS: Protein flexibility description from atomistic molecular dynamics simulations. Nucleic Acids Research, 52(D1), D384–D392. https://doi.org/10.1093/nar/gkad1084
35. Ren, F., Ding, X., Zheng, M., Korzinkin, M., Cai, X., Zhu, W., Mantsyzov, A., Aliper, A., Aladinskiy, V., Cao, Z., et al. (2023). AlphaFold accelerates artificial intelligence powered drug discovery: Efficient discovery of a novel CDK20 small molecule inhibitor. Chemical Science, 14(6), 1443–1452. https://doi.org/10.1039/D2SC05709C
36. Zheng, H., Lin, H., Alade, A. A., Chen, J., Monroy, E. Y., Zhang, M., & Wang, J. (2025). AlphaFold3 in drug discovery: A comprehensive assessment of capabilities, limitations, and applications. bioRxiv. https://doi.org/10.1101/2025.04.07.647682
37. Harmalkar, A., Lyskov, S., & Gray, J. J. (2025). Reliable protein-protein docking with AlphaFold, Rosetta, and replica exchange. eLife, 13, RP94029.
38. Wang, W., Feng, C., Han, R., et al. (2023). trRosettaRNA: Automated prediction of RNA 3D structure with transformer network. Nature Communications, 14, 7266. https://doi.org/10.1038/s41467-023-42528-4
39. Zheng, W., Wuyun, Q., Li, Y., Liu, Q., Zhou, X., Peng, C., Zhu, Y., Freddolino, P. L., & Zhang, Y. (2025). Deep-learning-based single-domain and multidomain protein structure prediction with D-I-TASSER. Nature Biotechnology, 43, 1056–1066.
40. Fang, Z., Ran, H., Zhang, Y., Chen, C., Lin, P., Zhang, X., & Wu, M. (2025). AlphaFold 3: An unprecedented opportunity for fundamental research and drug development. Precision Clinical Medicine, 8(3), pbaf015. https://doi.org/10.1093/pcmedi/pbaf015
41. Desai, D., Kantliwala, S. V., Vybhavi, J., Ravi, R., Patel, H., & Patel, J. (2024). Review of AlphaFold 3: Transformative advances in drug design and therapeutics. Cureus, 16(7), e63646. https://doi.org/10.7759/cureus.63646
42. Peng, C., Ni, W., Liu, Q., Hu, G., & Zheng, W. (2025). A comprehensive benchmarking of the AlphaFold3 for predicting biomacromolecules and their interactions. Briefings in Bioinformatics, 26(6), bbaf616. https://doi.org/10.1093/bib/bbaf616

Bioinforange