Her ne kadar santral dogma; DNA, RNA ve protein hiyerarşisine sahip olsa da RNA Dünyası hipotezi yaşamın başlangıcının ve evrimsel süreçlerin RNA tabanlı olduğunu ifade etmektedir. Bu hipotez RNA’nın kendi kendini kopyalayabileceği fikrine dayanmaktadır. In vitro araştırmalar ve mühendislik yaklaşımları, günümüzde RNA polimeraz ribozimlerinin (RPR’ler) keşfine ve katalitik sınıf I ligaz başta olmak üzere verimli RPR’lerin sentezine olanak sağlamıştır. RPR’lerin trinükleotid (üçlü) fosfatları substrat (bir üçlü polimeraz ribozim [TPR]) olarak kullanabildiği ve kendi dizisine benzerlik gösteren RNA şablonlarını kopyalama kabiliyetine sahip oldukları da gösterilmiştir; ancak otonom bir replikasyon için gerekli olan kararlı yapıya sahip RNA dublekslerinin ayrışması, iplik ayırma problemi nedeniyle temel bir engel oluşturmaktadır.
Kristoffersen ve arkadaşları çalışmalarında, viroid dairesel RNA’larının (circRNA) kendilerini şablon olarak kullandığı (yani RNA tarafından katalizlenen) yuvarlanan daire sentezi (RCS) aracılı RNA replikasyonuna odaklanarak, iplik ayırma problemini çözmek için potansiyel olarak düşündükleri scRNA (small conditional RNA) şablonlarının üçlü tabanlı RCS’sini araştırmıştır. RCS mekanizmasında dairesel bir şablon üzerinde gerçekleşen üçlü tabanlı RNA replikasyonu, dublekslerin ayrışmasını takiben sentezlenen iplikte hem 3′ ucunun uzamasına hem de üçlü artışlarla 5′ ucunun eşit yer değiştirmesine yol açmaktadır. Bu bilgiden yola çıkarak araştırmacılar, scRNA’nın şablon olarak kullanıldığı bir RNA replikasyonu modelinde RNA katalizörlerinin işlevleri araştırmıştır. Polimerizasyonda trinükleotid trifosfatı (pppNNN) substrat olarak kullanan yeni tanımlanmış bir TPR üzerinden yapılan deneyler ile tam uzunlukta ve ötesinde RNA sentezi gerçekleştirilmiştir.
Sonrasında RCS mekanizmasının scRNA’lar üzerindeki kısıtlamalarını anlamak için 36 nükleotid uzunluğundaki scRNA’nın şablon olarak kullanıldığı hem tek iplikli (ss) hem de çift iplikli (ds) RNA içeren, 400’ün üzerinde farklı RCS için atomistik moleküler dinamik (MD) simülasyonları gerçekleştirilmiştir. dsRNA 5′ ve 3′ uçlarının (yani, iplik yer değiştirmesi) artan yer değiştirmesine (soyulmasına) yol açan yeni oluşan dsRNA segmentinde gerilim biriktirerek RCS sürecine yardım edilebileceğini göstermektedir. Sonuçlar, Mg2+ iyonlarının varlığında bir scRNA şablonu üzerinde RNA dubleks yapının 5′ ve 3′ uçlarının eriyerek kararsızlaştığını ve RNA sentezi sürecinde artan nükleobaz maruziyetinin dinamiklerini ortaya koymuştur; ayrıca sentezlenen RNA uzunluğunun 200 baz çifti ve üzerinde olması gerektiği önerilmiştir. Sonrasında yeni (primer) ipliğin yer değiştirmesini içeren tek bir tam uzunluğun ötesinde circRNA sentezindeki RCS’yi göstermesi için, RCS’den elde edilen RNA ürünlerini, TPR’nin şablonlanmamış terminal transferaz (TT) aktivitesinden kaynaklananlardan ayırma amacıyla barkodlu şablonlar oluşturulmuştur. Bu şablonlar dairesel ve doğrusal RNA’lar olarak hazırlanarak tek kap astar uzatma (one-pot primer extension) deneyleri gerçekleştirilmiş, elde edilen ürünler jel elektroforezinde ayrılarak tam uzunluktaki RNA moleküllerin geri eldesi sağlanmıştır. Bu RNA’ların dizileme analizi, dairesel ve doğrusal scRNA şablonları üzerinde RNA katalizli RCS mekanizmasının gerçekleştiğini göstermiştir. Araştırmacılar, scRNA şablonu üzerinde iki primer varlığı ile ifade edilen dallı (branched) RCS yaklaşımıyla, RCS verimliliğinin dinamiklerini incelemiştir. Dört termal donma-çözülme döngüsüne tabi tutulan RNA katalizli dallı RCS ürünlerinin dizilenerek, bunların izotermal koşullarda konkatemer (uzun) RNA’lar oldukları ve RCS’nin bu ürünleri daha verimli üretebildiği tespit edilmiştir. Çalışmanın son aşamasında, viroid benzeri bir RNA replikasyonunun sadece RNA tarafından katalizlenme durumunu incelemek amacıyla mikro-çekiç (micro-hammerhead) başlı ribozimi (uHHz) ve bunun bölünme için substratını kodlayan 39 baz çifti uzunluğunda scRNA şablonunu içeren bir proto-viroid RNA tasarlanmıştır. Birkaç adım olarak tasarlanan viroid benzeri bir RNA replikasyon döngüsünde, bu döngünün sadece yarısının oluştuğu doğrulanırken (bir (-)-şeritli scRNA şablonundan bir (+)-şeritli scRNA oluşumu) bu döngünün tek başına yalnızca RNA tarafından da katalizlenebileceğine dair bir potansiyel olduğu gösterilmiştir.
Bu çalışma, viroid benzeri bir replikasyon şeması kullanıldığında ribozimler aracılığıyla RCS gerçekleşebileceğini ve bu mekanizmanın RNA replikasyonunda karşılaşılan iplik ayırma probleminin çözümüne katkı sağlayabileceğini göstermektedir. RNA katalizli RNA sentezine dair elde edilen veriler RNA dünyasına ait mevcut bilgilerin gelişmesine ve RNA tabanlı replikasyon modellerinin oluşturulmasına zemin hazırlaması açısından önem arz etmektedir.
Yazar: İrem Coşkuntan
Editör: Elif Duymaz
Referans: Kristoffersen, E. L., Burman, M., Noy, A., & Holliger, P. (2022). Rolling Circle RNA Synthesis Catalysed by RNA. ELife, 11. https://doi.org/10.7554/ELIFE.75186
-Bioinforange Bilimsel Haber Merkezi-
Haber Yazıları, 20> Etki Faktörlü Q1 dergilerinde yayınlanan (listesi için tıklayınız)
bilimsel araştırmaların ekip arkadaşlarımız tarafından incelenip derlenmesi ile hazırlanmaktadır.
Biyolog, Radyoterapi teknikeri. İstanbul Üniversitesi Aziz Sancar Deneysel Tıp Araştırma Enstitüsü / MSc. Genetik, doktora öğrencisi, İ.Ü. Bilgisayar Programcılığı öğrencisi.
İlgi alanları; inflamasyon genetiği, kanser genetiği, hücre biyolojisi, immünoloji, biyoinformatik, biyoistatistik, radyasyon onkolojisi.