Eksozomlar, hücre dışı veziküller olup tümör metastazında ve hücrelerarası iletişimde önemli rol oynamaktadır. Zhu ve arkadaşları kanser teşhisinde ve immünoterapi sonuç tahmininde biyobelirteç olarak eksozomal programlanmış hücre ölümü ligandı 1’in (PD-L1) kullanılabileceğini göstermiştir. exoPD-L1’in heterojen glikozilasyonu, PD-L1/PD-1 etkileşimlerinin temeli olup CD8+ T hücre aktivitesini negatif yönde regüle etmektedir. Ancak güncel tayin yöntemleri, bunu ölçme kapasitesine sahip değildir. Bu araştırmada glikozile edilmiş exoPD-L1’in nicel olarak ölçülebilmesi için gerçek zamanlı kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (RT-qPCR) ile beraber aptamer ve lektin kaynaklı (Concanavalin A, ConA) bir yakınlık ligasyon tahlili (PLA) geliştirilmiştir.
PLA yönteminde, exo-PD-L1’in tayini için ligandı tanıyan aptamer ve metabolik glikan etiketlemesi için ConA probları tasarlanarak, DNA ile konjugasyon hedeflenmiştir (Optimize edilmiş reaksiyon koşulları için 1:40 molar oranı seçilmiştir.). Glikozile exoPDL1’in hassas tayini için toehold yer değiştirmeli DNA afinite analizi (toehold displacement-mediated DNA affinity pull-down assay) kullanılmıştır. Bu analiz, konjuge edilmemiş ConA’yı ortadan kaldırmak ve ConA-DNA probunu saflaştırma amacıyla gerçekleştirilmiştir. Saflaştırma ürünleri daha sonra SDS-PAGE (sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezi) ile görselleştirilmiştir.
PD-L1 proteinlerinin glikozile olduğunu kanıtlamak için A375 insan melanoma hücresinden alınan eksozomlar model olarak kullanmışlardır. İlk olarak birbirine afinitesi olan 2 molekülün bağlanma performansları incelenmiş ve ilgili afinite problarında kontrol DNA sekansı ile kontrol antikoruna kıyasla belirgin floresan artışları saptanmıştır (Floresan ışıma miktarındaki artış, molekülün ideal bağlanma performansını belirlemektedir.). İki probun yaklaşık ve eşzamanlı tanınmasının mümkün olduğunun doğrulanması için lazer taramalı konfokal mikroskop (CLSM) ile incelenmiş ve floresan rezonans enerji transferi (FRET) sinyalleri, yalnızca PD-L1-L-Cy3 ve ConA-DNACy5 beraber var olduğunda gözlemlenmiştir.
Glikozile exoPD-L1’in yakınlık ligasyon testinin amplifikasyonunun olabilirliğini araştırmak için A375 eksozomlarına inkübe edilen DNA probları, yakınlık ligasyonuna tabi tutulmuş ve PCR ile amplifiye edilmiştir. Elde edilen amplifikasyon ürünleri agaroz jel elektroforezi ile doğrulanmıştır. Pozitif numuneler (PD-L1-L’li A375 eksozomları, ConA-DNA ve konektör) gözlemlenmesi beklenen ürün fragmanlarıyla tutarlılık gösterirken, kontrol gruplarında (PD-L1-L’siz A375 eksozomları ve ConA-DNA) bant gözlemlenmemiştir. Ligasyon reaksiyonunun iki afinite probunun aynı anda aynı eksozoma bağlandığında başarılı şekilde tetiklendiği gösterilmiştir.
Yapılan son araştırmalarda exoPD-L1’in kanser teşhisi ve immünoterapi sonuçları için başarılı bir biyobelirteç olduğu keşfedilmiştir; ancak plazmada dolaşan toplam exoPD-L1 seviyesinin saptanması, kanserde yanlış pozitif veya negatif teşhis sonuçları vermektedir. Var olan yöntemlerin dolaşımdaki toplam exoPD-L1 miktarını saptayıp PD-L1/PD-1 için temel olan PD-L1 proteinin glikozilasyon modifikasyonundaki heterojenliğin tespit edilememesinin bu duruma sebep olduğu düşünülmektedir. Bu araştırmada CD8+ T hücrelerinin aktivitesini inhibe ettiği için glikozile edilmiş exoPD-L1 seviyesinin kanser teşhisi için potansiyel bir biyobelirteç olduğu keşfedilmiştir.
İki afinite molekülünün akış (flow) sitometri analizi ile plazmadaki eksozomlara karşı bağlanma özellikleri incelenmiştir. Her iki numune karşılaştırıldığında PD-L1-L prob lekelerinde floresan kayması gözlemlenmiştir. Bu kaymanın sebebi ise sağlıklı donörlerin kanında tümör hücresi kaynaklı olmayan exoPD-L1 bulunmasıdır. Kanser hastalarında toplam glikozilasyon farkı karşılaştırıldığında sağlıklı donörlerde bu değerlerin daha yüksek olduğu tespit edilmiştir. Bu sonuca göre geliştirilmiş iki afinite probunun klinik numunelerde glikozile exoPD-L1’in nicel analizi için tanıma molekülü olarak kullanılabileceği düşünülmüştür. Buna karşılık, PD-L1 aptamer tanıma ve daha sonraki qPCR’a dayalı dolaşımdaki toplam exoPD-L1 seviyeleri; sağlıklı donörleri kanser hastalarından ayırt edememiştir.
Sonuç olarak geliştirilmiş strateji ile glikozile exoPD-L1’in doğru şekilde nicel analizi sağlanmıştır. Bu değerlerin dolaşımdaki toplam exoPD-L1 düzeyiyle karşılaştırılması sonucunda tümör tanısı için glikozile exoPD-L1’in daha güvenilir bir biyobelirteç olduğu gösterilmiştir.
Referans: Zhu, L., Xu, Y., Kang, S., Lin, B., Zhang, C., You, Z., Lin, H., Yang, C., & Song, Y. (2022). Quantification-Promoted Discovery of Glycosylated Exosomal PD-L1 as a Potential Tumor Biomarker. Small Methods, 2200549. https://doi.org/10.1002/SMTD.202200549
Yazar: Aleyna Tuğçe Efecan
Editör: Sema Yöşili
-Bioinforange Bilimsel Haber Servisi-
Haber Yazıları, 20> Etki Faktörlü Q1 dergilerinde yayınlanan (listesi için tıklayınız)
bilimsel araştırmaların ekip arkadaşlarımız tarafından incelenip derlemesi ile hazırlanmaktadır.
Bursa Teknik Üniversitesi- Biyoteknoloji Yüksek Lisans Öğrencisi