CRISPR-Cas9 teknolojisi, DNA dizilerinin hedefli biçimde değiştirilmesine olanak sağlayan genom düzenleme yöntemlerinin temel araçlarından biridir. Bununla birlikte, mevcut Cas9 enzimlerinin etkinliği çevresel koşullara bağlı olarak değişebilmektedir. Bu nedenle farklı sıcaklık ve tuzluluk koşullarında işlev gösterebilen yeni nükleazların belirlenmesi, genom düzenleme araçlarının çeşitlendirilmesi açısından önem taşımaktadır.
Olaso-Llorca ve çalışma arkadaşları, derin okyanus ortamından elde edilen metagenomik veriler üzerinden yeni bir Cas9 nükleazını karakterize ederek bu alana katkı sağlamıştır. Araştırmacıların temel amacı, düşük sıcaklıklarda DNA kesme etkinliğini koruyabilen ve yaygın kullanılan Streptococcus pyogenes kaynaklı SpCas9 enziminden farklı biyofiziksel özellikler sergileyen bir Cas9 sistemi tanımlamaktır. Çalışmada incelenen Deep Ocean 1 Cas9 (DO1Cas9), Atlantik Okyanusu’nda 1.500 metre derinlikten alınan bir örneğe ait metagenomik veriler üzerinden tanımlanmıştır. Metagenomik analiz, bir çevrede bulunan mikroorganizmaların genetik materyalinin topluca incelenmesini sağlamaktadır. Araştırmacılar, enzimin yalnızca düşük sıcaklıklardaki etkinliğini değil, yapısal esnekliğini, sıcaklığa duyarlılığını, tuz konsantrasyonuna bağlı kararlılığını ve hedef DNA’yı tanıma özgüllüğünü de incelemiştir.
Çalışmada öncelikle DO1Cas9 ile ilişkili kılavuz RNA dizileri belirlenmiş ve enzimin DNA’yı tanımasında rol oynayan PAM (protospacer adjacent motif; hedef DNA dizisinin yakınında bulunan ve Cas9 tarafından tanınan kısa DNA motifi) gereksinimleri araştırılmıştır. Ardından AlphaFold tabanlı yapısal modelleme yöntemleriyle proteinin olası yapısal özellikleri değerlendirilmiş, nanoDSF (nanodiferansiyel taramalı florimetri; proteinlerin sıcaklık karşısındaki yapısal kararlılığını inceleyen yöntem) kullanılarak termal davranışı analiz edilmiştir. Yapısal modellemeler, DO1Cas9’un özellikle hedef tanıma ve DNA kesiminde görev alan bölgelerinde daha yüksek hareketlilik gösterebildiğine işaret etmiştir. Ayrıca artan tuz konsantrasyonunun enzimin termal kararlılığını yükselttiği ve düşük tuz koşullarıyla yüksek tuz koşulları arasında erime sıcaklığında (Tm) yaklaşık 4 °C’lik artış meydana geldiği bildirilmiştir. Kontrollü koşullarda gerçekleştirilen in vitro DNA kesme deneylerinin yanı sıra DO1Cas9’un in vivo genom düzenleme etkinliği Caenorhabditis elegans, zebra balığı (Danio rerio), deniz tulumlusu Oikopleura dioica ve sıtma paraziti Plasmodium falciparum gibi farklı organizmalarda da değerlendirilmiştir.
Bulgular, DO1Cas9’un düşük sıcaklıklarda DNA kesme bakımından SpCas9’dan ayrıldığını göstermektedir. Kontrollü in vitro deneylerde DO1Cas9, 7,6 °C’de çift iplikli DNA’yı kesebilmiştir. SpCas9 ise aynı düşük sıcaklık koşullarında yalnızca daha uzun inkübasyon sonrasında düşük düzeyde kesme etkinliği göstermiş ve ulaştığı etkinlik DO1Cas9’un yaklaşık üçte biriyle sınırlı kalmıştır. Bununla birlikte, düşük sıcaklık deneylerinde kullanılan reaksiyon süresine ilişkin makalenin ana metni ve şekil açıklamasında farklı süreler bildirilmiştir. DO1Cas9 ayrıca kılavuz RNA ile hedef DNA arasındaki +1, +3 ve +5 pozisyonlarındaki uyumsuzluklara SpCas9’dan daha duyarlı bulunmuştur. Bu sonuç, test edilen deneysel koşullarda daha yüksek hedef özgüllüğüne işaret etmektedir; ancak genom çapında hedef dışı kesimlerin tamamen ortadan kalktığını göstermemektedir.
DO1Cas9’un farklı organizmalardaki genom düzenleme etkinliği de çeşitli deneylerle incelenmiştir. C. elegans üzerinde dpy-10 genini hedefleyen deneylerde, floresan belirteç taşıyan F1 bireylerinin yaklaşık %30–50’sinin F2 neslinde Dumpy (Dpy) fenotipli yavrular oluşturduğu bildirilmiştir. Zebra balığında (Danio rerio) ise tbxta ve slc45a2 genleri hedeflenmiştir. DO1Cas9’un RNA formunda uygulandığı deneylerde sıcaklık arttıkça tbxta hedefindeki kuyruk fenotipinin görülme oranı yükselirken, önceden oluşturulmuş protein-RNA kompleksi (RNP) kullanıldığında daha düşük sıcaklıklarda daha yüksek fenotip oranları elde edilmiştir. Araştırmacılar, RNA uygulamasındaki bu farklılığın yüksek sıcaklıklarda mRNA çevirisinin artmasıyla ilişkili olabileceğini değerlendirmiştir.
Deniz tulumlusu Oikopleura dioica üzerinde Brachyury genini hedefleyen deneylerde DO1Cas9 ve SpCas9 karşılaştırılabilir düzenleme etkinliği göstermiş, embriyoların yaklaşık %13’ünde beklenen küçülmüş kuyruk fenotipi gözlenmiştir. Bu deneyde iki enzim arasında anlamlı bir üstünlük gösterilmemiştir. Sıtma paraziti Plasmodium falciparum üzerinde gerçekleştirilen deneylerde ise DO1Cas9 aracılığıyla oluşturulan DNA kesimlerinin, 28 °C ve 37 °C koşullarında donör DNA kalıbı kullanılarak homoloji yönlendirmeli onarım (HDR) yoluyla onarıldığı gösterilmiştir.
Deniz bakterisi Marinomonas mediterranea üzerinde yürütülen faj enfeksiyonu deneylerinde ise DO1Cas9, hedeflenen CB5A fajına karşı plak oluşum verimliliğini SpCas9’a kıyasla daha güçlü biçimde düşürmüştür. Göreceli plak oluşum verimliliği (RPE), DO1Cas9 kullanılan koşullarda 28 kat, SpCas9 kullanılan koşullarda ise 2,3 kat azalmıştır. Bu sonuç, DO1Cas9’un incelenen bakteri-faj sisteminde faj enfeksiyonuna karşı daha güçlü bir girişim sağladığını göstermektedir.
Bu sonuçlar, DO1Cas9’un düşük sıcaklıklarda genom düzenleme ve deniz biyoteknolojisi araştırmaları açısından değerlendirilebilecek farklı özelliklere sahip bir Cas9 enzimi olduğunu ortaya koymaktadır. Enzimin soğuğa uyarlanmış yapısal esnekliği, tuz konsantrasyonuna bağlı kararlılığı ve sıcaklık yükseldiğinde etkinliğinin azalması, belirli deneysel koşullarda kullanılabilecek bir araç olabileceğini düşündürmektedir. Bununla birlikte, araştırmacılar düzenleme etkinliğinin reaksiyon koşullarının optimizasyonu veya protein mühendisliği yoluyla daha da geliştirilebileceğini belirtmektedir. Bildirilen bulgular bir bioRxiv ön baskısına dayanmaktadır ve çalışma henüz hakem değerlendirmesinden geçmemiştir. Dolayısıyla DO1Cas9’un uygulama alanları, etkinliği ve sınırlılıkları hakkında daha kapsamlı değerlendirmeler yapılabilmesi için sonuçların bağımsız çalışmalarla doğrulanması gerekmektedir.
Yazar: Meryem Irmak Şen
Editör: Asmin Petekbaşı
Referans: Olaso-Llorca, A., Colizzi, F., Mingarro, G., Sánchez, P., Sánchez-Bolaños, C., Molina, C. A., Martínez-Cazorla, A., Serrano-Durán, R., Urbaitis, T., Rodrigo Melero, N., Bosch, A., Magallon-Mosella, M., Margitfalvi, M., Stitilyte, M., Carolis, C., Romero-Moya, D., Giorgetti, A., Velázquez-Mudarra, A., Rajkovskii, D., … Cerón, J. (2026). A cold-adapted Cas9 nuclease from the deep ocean [Preprint]. bioRxiv. https://doi.org/10.64898/2026.10.14.759226
-Bioinforange Bilimsel Haber Servisi-
Haber Yazıları, 20> Etki Faktörlü Q1 dergilerinde yayınlanan (listesi için tıklayınız)
bilimsel araştırmaların ekip arkadaşlarımız tarafından incelenip derlenmesi ile hazırlanmaktadır.
