Uzamsal Transkriptomik: Gen İfadesini Doku İçindeki Konumla Birleştiriyor

Özet

Geleneksel dökme (bulk) ve tek hücre RNA dizileme yöntemleri, dokunun enzimatik ya da mekanik olarak ayrıştırılması sırasında hücrelerin özgün fiziksel konum bilgilerinin yitirilmesine neden olmaktadır. Uzamsal transkriptomik (ST) teknolojileri, yüksek verimli gen ekspresyon profillemesini doku kesitinin koordinatlarıyla eşleştirerek biyolojik süreçlerin hücresel niş ölçeğinde incelenmesine zemin hazırlamaktadır. Bu derlemede, yeni nesil dizileme tabanlı katı faz barkodlama platformları ile görüntüleme temelli in situ hibridizasyon ve dizileme sistemlerinin çalışma mekanizmaları ayrıntılı biçimde ele alınmaktadır. Platformların uzamsal çözünürlük sınırları, transkript yakalama duyarlılıkları ve difüzyon dinamikleri karşılaştırmalı olarak değerlendirilmektedir. Ayrıca hücre tipi dekonvolüsyonu, uzamsal değişken genlerin tespiti ve hücreler arası sinyal ağlarının haritalanmasında yararlanılan biyoinformatik algoritmalar irdelenmektedir. Elde edilen mekânsal verilerin tümör mikroçevresi, nörobiyoloji ve gelişim biyolojisi çalışmalarındaki yansımaları güncel literatür ışığında incelenmektedir.

Anahtar Kelimeler: Uzamsal transkriptomik, tek hücre entegrasyonu, doku heterojenliği, hücre tipi dekonvolüsyonu, tümör mikroçevresi, uzamsal değişken genler.

1. Giriş

Çok hücreli organizmalarda doku homeostazı, gelişimsel morfogenez ve patofizyolojik süreçler, hücrelerin içsel genetik programları ile doku mikroçevresi içindeki komşuluk ilişkilerinin dinamik etkileşimiyle yönetilmektedir^1,2. Geleneksel dökme RNA dizileme (bulk RNA-seq) analizleri, dokudaki ortalama transkript seviyelerini yansıtarak nadir hücre popülasyonlarını maskelemektedir³. Tek hücre RNA dizileme (scRNA-seq) yaklaşımları transkriptomik heterojenliğin tekil hücre ölçeğinde çözümlenmesini sağlamış; ancak hücre süspansiyonu eldesi sırasında doku mimarisinin ve fiziksel koordinatların yitirilmesine neden olmuştur^4,5. Bu kısıtlılığı aşmak üzere geliştirilen uzamsal transkriptomik (Spatial Transcriptomics – ST), mRNA moleküllerini intakt doku kesitleri üzerindeki konumlarını koruyarak haritalayan moleküler ve hesaplamalı platformları temsil etmektedir⁶. Bu metodoloji sayesinde hücresel kimlikler, patolojik odaklar ve doku içi mikroçevre nişleri doğrudan histolojik bağlamında incelenebilmektedir^2,7.

2. Tek Hücre Profillemesinden Mekânsal Boyuta: Uzamsal Transkriptomik Neden Gereklidir?

Genomik ve transkriptomik alanındaki bulgular, bir hücrenin sergilediği fonksiyonel durumun yalnızca çekirdeğindeki transkripsiyonel regülasyondan ibaret olmadığını hücre dışı matriks bileşenleri, lokal morfojen gradyanları ve komşu hücrelerle kurulan fiziksel temas ağı tarafından şekillendirildiğini göstermektedir^1,7. Dolayısıyla tekil hücrelerden elde edilen derin transkriptom profillerinin biyolojik anlam kazanabilmesi, bu hücrelerin dokunun üç boyutlu anatomik koordinat sistemine doğru şekilde oturtulmasını zorunlu kılmaktadır^1,6.

 2.1 Doku Ayrıştırmasının Kısıtlılıkları ve scRNA-seq Paradoksu

scRNA-seq iş akışlarında karşılaşılan en temel metodolojik engel, analizin canlı ve tekil hücre süspansiyonlarına bağımlı olmasıdır^4,5. Katı dokuların tripsin ve kolajenaz gibi enzimlerle parçalanması ya da mekanik olarak homojenize edilmesi sırasında hücreler şiddetli fiziksel ve kimyasal strese maruz kalmaktadır^5,8. Bu süreçte proteolitik maruziyet ve inkübasyon süreleri; erken hücre lizisine, hücre ölümüne ve yapay kümelenmelere yol açabilmektedir^5,8. Dahası, uygulanan ayrıştırma protokollerinin hücrelerde fizyolojik olmayan stres yanıtlarını indüklediği, bu kapsamda şaperon görevi gören HSP gen ailesi ile FOS ve JUN gibi erken yanıt transkripsiyon faktörlerinin yapay aktivasyonuna neden olduğu bildirilmektedir⁸. 

Uygulanan ayrıştırma yöntemlerinin verimliliği hücre tipleri arasında da belirgin bir seçilim yanlılığı yaratmaktadır^2,5. Kanda veya lenfoid organlarda süspansiyon halinde bulunan T ve B lenfositleri bütünlüklerini koruyarak izole edilebilirken, santral sinir sistemindeki dallanmış nöronlar, kemik dokusundaki osteositler veya kardiyomiyositler gibi matrise kuvvetli bağlarla tutunmuş hücreler disosiasyon sırasında parçalanarak kaybedilmektedir^2,5,8. Bunun sonucunda kütüphaneler dokunun gerçek hücresel kompozisyonunu yansıtmakta yetersiz kalmakta; intakt doku kesitleri üzerinde morfolojik konumu koruyan uzamsal profilleme yaklaşımlarına duyulan gereksinim belirginleşmektedir (Şekil 1)^2,6.

Şekil 1. Tek hücreli ve uzamsal transkriptomik verilerin entegrasyonu ile doku mikro çevresindeki hücresel ekotiplerin haritalanması. Farklı doku ve model organizmalardan elde edilen tek hücreli ve uzamsal transkriptomik profilleme verilerinin doku mimarisi ölçeğinde birleştirilme süreci şematize edilmiştir. Tek hücre RNA dizileme verileri; hücresel durumların, hücre tiplerinin ve gelişimsel yörüngelerin tanımlanmasında kullanılmaktadır. Bu hücre popülasyonları, doku kesiti üzerinde tekrarlayan ve birbirine yakın konumlanan çok hücreli komşuluklar (uzamsal ekotipler) bağlamında haritalanmakta; bu sayede hücreler arası parakrin ve jukstakrin etkileşim ağları çözümlenmektedir. Transkriptomik verilere uygulanan makine öğrenimi ve yapay zekâ algoritmaları, yüksek boyutlu verilerin işlenmesine ve doku organizasyonuna dair yeni biyolojik modellerin geliştirilmesine olanak tanımaktadır. scRNA-seq: Single-cell RNA sequencing, ST: Spatial Transcriptomics¹.

 2.2 Hücresel Konumun, Mikroçevre Nişlerinin ve Yerel Sinyal Yolaklarının Rolü

Bir doku kesiti içindeki hücresel konum, çevresel uyaranlara verilen transkripsiyonel yanıtları etkileyen önemli etmenlerden biridir; ancak hücrenin içsel genetik, epigenetik ve gelişimsel durumu da bu yanıtların şekillenmesinde rol oynar^1,7. Doku içerisindeki oksijen seviyesi, besin gradyanları ve metabolik atık konsantrasyonları homojen bir dağılım göstermediğinden dolayı hücreler bulundukları mikro bölgeye bağlı olarak hipoksik veya metabolik stres koşullarına adapte olmaktadır1. Örneğin tümör dokularında damarlanmanın yetersiz olduğu nekrotik çekirdeğe yakın hücreler ile oksijence zengin periferik bölgedeki hücreler, aynı genetik mutasyonları taşımalarına rağmen tamamen farklı gen ekspresyon modelleri sergilemektedir¹.

Hücreler arası iletişim dinamikleri de büyük ölçüde fiziksel mesafe kısıtlamalarına ve mikro düzeyde çevresel gradyanlara tabidir^1,3,7. Doku mimarisini koruyan uzamsal yöntemler, ligand ve reseptörlerin doku içindeki dağılımını ve hücrelerin komşuluk ilişkilerini incelemeye yardımcı olur; ancak yalnızca transkriptlerin mekânsal birlikteliği, parakrin faktörlerin gerçek difüzyon yarıçapını veya Notch–Delta gibi temas bağımlı yolakların işlevsel olarak gerçekleştiğini tek başına kanıtlamaz^1,7. Klasik scRNA-seq analizlerinde fiziksel koordinatların kaybı, ligand–reseptör temelli hücreler arası iletişim çıkarımlarının gerçek hücresel komşuluk bilgisi olmadan yapılmasına yol açabilir^1,7,47. Uzamsal transkriptomik teknolojileri ise yüksek çözünürlüklü moleküler profillemeyi dokunun fiziksel ve morfolojik haritasıyla entegre etmektedir. Bu sayede immün hücrelerin tümör stromasına infiltrasyon derecesi, kök hücre nişlerindeki morfogenetik gradyanlar, sinaptik plastisite bölgeleri ve doku hasarı etrafında şekillenen lokal inflamatuar yanıtlar gerçek anatomik bağlamında ortaya konulmaktadır^1,7.

3. Uzamsal Transkriptomik Teknolojilerinin Metodolojik Esasları

Uzamsal transkriptomik yöntemleri,  moleküler yakalama ve okuma stratejilerine bağlı olarak dizileme tabanlı (sequencing-based) ve görüntüleme tabanlı (imaging-based) yaklaşımlar olmak üzere iki grupta sınıflandırılmaktadır (Şekil 2)^2,9.

Şekil 2. Görüntüleme ve dizileme tabanlı uzamsal transkriptomik metodolojilerinin temel iş akışları. Uzamsal transkriptomik teknolojilerinin moleküler yakalama ve okuma prensipleri dört ana kategoride şematize edilmiştir. Görüntüleme yöntemleri (Imaging methods): In situ hibridizasyon (ISH) yaklaşımında, hedef mRNA transkriptlerine florofor etiketli problar hibridize edilmekte ve ardışık döngülerle gene özgü floresan barkodlar kaydedilmektedir. In situ dizileme (ISS) yaklaşımında, hedef transkriptler yuvarlanan çember amplifikasyonu (RCA) ile çoğaltmakta kısa sorgu problarının ardışık bağlanması ve floresan sinyallerin görüntülenmesiyle nükleotit dizileri doğrudan doku üzerinde belirlenmektedir. Dizileme yöntemleri (Sequencing methods): Mikrodizilim (Arrays) yaklaşımında, doku kesiti uzamsal barkodlu problar içeren katı yüzeye aktarılmakta, mRNA’lar yüzey problarına bağlandıktan sonra yeni nesil dizileme (NGS) kütüphaneleri hazırlanmaktadır. Mikrodiseksiyon (Microdissection) yaklaşımında ise doku kesiti üzerindeki hedef mikrobölge (ROI) optik olarak belirlenmekte; UV ışığı veya lazer aracılığıyla serbest bırakılan problar kılcal tüplerle toplanarak NGS ile dizilenmektedir. ISH: In situ hybridization, ISS: In situ sequencing, mRNA: Messenger RNA, NGS: Next-generation sequencing, RCA: Rolling circle amplification, ROI: Region of interest, UV: Ultraviolet³.

3.1 Dizileme Tabanlı Yöntemler ve Katı Faz Barkodlama

Dizileme tabanlı uzamsal transkriptomik teknolojileri, tek hücre RNA dizileme platformlarında olgunlaşan oligonükleotit barkodlama kimyasının doku mimarisini ve koordinatlarını koruyacak biçimde katı bir substrat yüzeyine aktarılması ilkesine dayanmaktadır^2,6,9. Bu sistemlerin temel mimarisini; cam lam, polistiren mikroboncuk veya fotolitografik silikon çipler üzerine kovalent bağlarla sabitlenmiş oligonükleotit dizilimleri oluşturmaktadır^2,6,9. Söz konusu diziler; konumu kodlayan uzamsal barkodlar, aynı özgün molekülden kaynaklanan çoğaltılmış okumaların ayırt edilmesine ve molekül sayımlarının iyileştirilmesine yardımcı olan benzersiz moleküler tanımlayıcılar (Unique Molecular Identifiers—UMI) ve poliadenillenmiş mRNA moleküllerini yakalayan poli(T) problarını içerebilir; UMI kullanımı PCR kaynaklı tüm yanlılıkları bütünüyle ortadan kaldırmaz^6,9.

Doku kesitinin lam üzerine yerleştirilmesini takiben, hücre içi transkriptlerin yüzey problarına erişebilmesi amacıyla doku tipine göre optimize edilmiş kimyasal ya da enzimatik geçirgenleştirme adımı uygulanmaktadır^6,10. Bu aşamada hücre zarı geçirgenleştirilerek serbest kalan mRNA moleküllerinin dikey doğrultuda katı faza difüzyonu sağlanmakta ve yüzeydeki tamamlayıcı problarla hibritleşmesi gerçekleştirilmektedir^6,10. Katı yüzey üzerinde yürütülen in situ ters transkripsiyon reaksiyonuyla dokunun iki boyutlu koordinat bilgisi sentezlenen tamamlayıcı DNA (cDNA) kütüphanelerine kalıcı olarak entegre edilmektedir^6,10. Elde edilen barkodlu kütüphaneler yüzeyden enzimatik veya kimyasal yöntemlerle geri kazanılarak yeni nesil dizileme (NGS) platformlarında analiz edilmekte; transkriptomik veriler dokunun histolojik koordinatlarıyla eşleştirilerek Şekil 3’te gösterildiği gibi tarafsız bir yaklaşımla haritalanmaktadır^6,10.

Şekil 3. 10x Genomics Visium platformunun formalinle fikse edilmiş parafine gömülü (FFPE) dokular için deneysel iş akışı. Katı faz mikrodizilim tabanlı 10x Genomics Visium sisteminin laboratuvar ve hesaplamalı basamakları şematize edilmiştir. Mikrotom ile 6,5 mm yakalama alanlarına yerleştirilen doku kesitleri boyanmakta ve mikroskop altında morfolojik olarak görüntülenmektedir. Hedef mRNA dizilerine yönelik çift probların hibridizasyonu ve ligasyonunun ardından, RNaz muamelesi ile mRNA kalıbı uzaklaştırılmakta ve doku geçirgenleştirilerek serbest kalan ligasyon ürünleri lam yüzeyindeki uzamsal barkodlu problar tarafından yakalanmaktadır. Lam yüzeyindeki uzamsal barkodlara uzatılan problar toplanarak yeni nesil dizileme (NGS) kütüphaneleri oluşturulmaktadır. Elde edilen dizileme verileri hizalama, barkod ayrıştırma ve gen ifade matrisi analizi adımlarından geçirilerek histolojik doku koordinatları üzerinde görselleştirilmektedir. FFPE: Formalin-fixed paraffin-embedded, mRNA: Messenger RNA, NGS: Next-generation sequencing, RNase: Ribonuclease, Slide: 6,5 mm yakalama alanlı Visium lamı^2,10.

Bu teknolojilerin gelişim sürecindeki temel metodolojik mücadele, doku içi moleküler difüzyonu en aza indirirken uzamsal çözünürlüğü yüz mikrometre ölçeğindeki çok hücreli alanlardan subselüler nanometrik sınırlara taşıyabilmek olmuştur. Katı substratın geometrik tasarımına, barkod yoğunluğuna ve kullanılan taşıyıcı materyalin cinsine bağlı olarak dizileme tabanlı platformlar aşağıda sınıflandırılan farklı alt yaklaşımlar üzerinden evrilmiştir². 

3.1.1 Mikroarray Tabanlı Katı Faz Noktacık Sistemleri (ST ve Visium)

Katı faz üzerinde uzamsal barkodlama konsepti, ilk olarak cam lam üzerine mikrometre ölçeğinde basılmış barkodlu oligonükleotit dizileriyle hayata geçirilmiştir⁶. Klasik 10x Genomics Visium sürümünde yakalama alanı yaklaşık 6,5 × 6,5 mm boyutundadır ve her alanda yaklaşık 5.000 barkodlu noktacık bulunur; bu ölçüler platform sürümüne göre değişebileceğinden sürüm belirtilerek raporlanmalıdır⁴⁸.Klasik Visium spotları yaklaşık 55 µm çapındadır ve merkezden merkeze yaklaşık 100 µm aralıkla yerleşir^3,9,48.

Doku kesitinin lam üzerine yerleştirilip geçirgenleştirilmesinin ardından salınan mRNA transkriptleri yüzeydeki poli(T) dizilerine bağlanmakta, in situ ters transkripsiyon reaksiyonuyla uzamsal barkod cDNA kütüphanesine entegre edilmektedir^6,10. Visium’un taze dondurulmuş doku iş akışı poli(A) kuyruklarını yakalayan poli(dT) problarına dayanırken, FFPE iş akışında RNA-templated ligation yaklaşımıyla hedef RNA dizilerine bağlanan prob çiftleri kullanılır; bu iki iş akışının kimyası aynıymış gibi sunulmamalıdır^2,10. Spot düzeyindeki karışımların çözümlenmesinde hücre tipi dekonvolüsyonu yöntemleri kullanılabilir^11,29.

    3.1.2 Rastgele Birikimli Mikroboncuk Dizilimleri: Slide-seq ve Curio Seeker

Noktacık çapını hücresel boyut ölçeğine yaklaştırmak amacıyla geliştirilen Slide-seq yaklaşımında, mikroarray baskılı katı yüzeyler yerine ‘puck’ adı verilen cam taşıyıcılar üzerine rastgele saçılmış 10 µm çapındaki barkodlu polistiren mikro boncuklardan (monolayer beads) oluşan tek katmanlı bir tabaka kullanılmaktadır¹². Her bir mikroboncuk, kendine özgün bir uzamsal DNA barkodu ve Benzersiz Moleküler Tanımlayıcı (UMI) dizisi taşımaktadır12. Mikroboncukların yüzeydeki iki boyutlu koordinatları, dizileme öncesinde katı faz üzerinde gerçekleştirilen ligasyon tabanlı dizileme (Sequencing by Oligonucleotide Ligation and Detection – SOLiD) yöntemiyle optik olarak haritalandırılmaktadır¹². Dokunun parçalanmasıyla serbest kalan poliadenillenmiş mRNA molekülleri, bu boncuklar üzerindeki oligonükleotid dizileri tarafından yakalanır ve ters transkripsiyon reaksiyonuyla cDNA’ya dönüştürülmektedir¹².

İlk nesil Slide-seq yönteminde düşük transkript yakalama verimliliği bildirilirken, kütüphane hazırlama basamaklarının optimize edildiği Slide-seqV2 protokolünde mRNA yakalama duyarlılığı yaklaşık on kat artırılmıştır¹³. Slide-seqV2, yaklaşık 10 µm uzamsal çözünürlük sayesinde tek hücre ölçeğine yakın seviyede transkriptomik profilleme sunabilmektedir¹³. Ancak yöntemin en kritik teknik zorluklarından biri, elde edilen mikromorfometrik görüntülerin lam üzerindeki koordinatlarla tam örtüşebilmesi için gelişmiş ve hassas hizalama protokollerine gereksinim duymasıdır^2,13.

Slide-seq teknolojisi, laboratuvar içi optimizasyon süreçlerinin zorluğu, mikro morfometrik hizalama gereksinimleri ve “puck” üretimindeki standardizasyon eksiklikleri nedeniyle ilk aşamada yaygınlaşmakta güçlük çekmiştir. Bu sınırlılıkları aşmak adına teknoloji, Curio Bioscience firması tarafından Curio Seeker adıyla ticarileştirilmiştir².

    3.1.3 Desenli DNA Nanoküre Matrisleri ve Subselüler Çözünürlük: Stereo-seq ve Seq-Scope

Subselüler boyutta tüm transkriptom yakalamasını sağlamak amacıyla fotolitografi ve desenli çip (patterned array) teknolojilerinden yararlanan yeni nesil dizileme platformları geliştirilmiştir^2,14. Stereo-seq platformunda desenli bir çip üzerindeki DNA nanoküreleri (DNA nanoballs—DNB) uzamsal olarak indekslenmiş yakalama bölgeleri sağlar; çip geometrisi ve kullanılan analiz binleri çözünürlüğü etkilediğinden tek bir merkez aralığı tüm uygulamalar için evrensel bir etkin çözünürlük olarak sunulmamalıdır^2,14. Nanokürelerin koordinatları çip üzerinde dizilendikten sonra doku kesiti yüzeye aktarılmakta ve yüksek yoğunluklu transkript yakalaması gerçekleştirilmektedir¹⁴. DNB diziliminin yüksek yoğunluğu, geniş doku alanlarında ayrıntılı uzamsal profillemeyi destekler; bununla birlikte hücresel veya hücre içi ayrıntıların elde edilmesi yalnızca fiziksel barkod yoğunluğuna değil, doku hazırlama, geçirgenleştirme, transkript yakalama ve analizde kullanılan bin boyutuna da bağlıdır^2,14. Doku geçirgenleştirilmesini takiben serbest kalan mRNA molekülleri, bu nanoküreler üzerindeki özel yakalama probları ile hibridize edilerek uzamsal koordinat bilgisiyle birlikte sentezlenen cDNA kütüphanelerine dönüştürülmektedir¹⁴. Yapılan işlemler sırası ile Şekil 4’te gösterilmiştir. 

Şekil 4. Stereo-seq platformunda desenli çip ve DNA nanoküreleri (DNB) aracılığıyla uzamsal transkript yakalama prensibi. Çip üzerindeki uzamsal indeksli DNB bölgelerinin koordinatlandırılması ve doku kesitinden transkript yakalanması şematik olarak gösterilmiştir. Etkin çözünürlük, çip tasarımı ve analizde kullanılan bin boyutuna bağlıdır . cDNA: Complementary DNA, CID: Coordinate Identifier, DNB: DNA Nanoball, MID: Molecular Identifier, UMI: Unique Molecular Identifier¹⁴ .

Benzer biçimde Illumina dizileme akış hücrelerinin optik kümeleme mimarisinden faydalanan Seq-Scope protokolü, katı yüzeydeki klonal DNA kümelerini 0,5–1 µm çözünürlükte uzamsal barkod merkezleri olarak kullanmaktadır¹⁵. İlk aşamada akış hücresi üzerinde gerçekleştirilen kümeleme dizilemesi ile rastgele oluşturulmuş dizilerin kesin koordinatları belirlenmekte, ardından bu yüzeye aktarılan doku kesitlerinden salınan transkriptler doğrudan bu uzamsal kümeler tarafından yakalanmaktadır¹⁵. Bu subselüler platformlar, tek bir hücrenin sitoplazması ile çekirdeği arasındaki transkript dağılımını ve organel düzeyindeki RNA lokalizasyonlarını ayırt edebilecek düzeyde yüksek bir mekânsal hassasiyet sağlamaktadır¹⁵. Ancak üretilen çok yüksek hacimli ve yoğun verilerin tekil hücre sınırlarına göre bölünmesi aşamasında, yalnızca hücresel boya veya DAPI (4′,6-diamidino-2-fenilindol)/Eosin görüntülemesine dayanmak yetersiz kalabilmektedir^2,15. Bu durum, derin öğrenme tabanlı hücre bölünme algoritmaları ve transkript yoğunluk haritalarını birleştiren ileri seviye biyoinformatik modellemeleri zorunlu kılmaktadır^2,15.

    3.1.4 Mikroakışkan Tabanlı İki Yönlü Çapraz Barkodlama (DBiT-seq)

Diğer dizileme tabanlı yöntemlerden farklı olarak uzamsal omik dizileme için dokuda deterministik barkodlama (Deterministic Barcoding in Tissue for spatial omics sequencing – DBiT-seq), dokudan mRNA salınımı yerine reaktiflerin doku üzerine doğrudan mikroakışkan kanallarla yönlendirilmesi ilkesine dayanmaktadır¹⁶. Bu yöntemde, doku kesiti üzerine önce birbirine paralel 50 mikrokanal içeren bir polidimetilsiloksan (PDMS) çip yerleştirilmekte ve birinci uzamsal barkod (Barkod A) kanallardan enjekte edilerek in situ ters transkripsiyon gerçekleştirilmektedir¹⁶.

İkinci aşamada ilk çip kaldırılmakta ve birinci kanallara 90 derece dik açıyla yerleştirilen ikinci bir PDMS çip aracılığıyla ikinci uzamsal barkod seti (Barkod B) uygulanmaktadır¹⁶. Bu iki barkodun kesişim noktalarında enzimatik ligasyonla birleştirilmesi sonucunda, doku yüzeyinde her bir kesişim pikseline kanal genişliğine bağlı olarak 10 µm, 20 µm veya 50 µm özgü benzersiz iki boyutlu bir koordinat matrisi (A×B) oluşturulmaktadır¹⁶. DBiT-seq platformu, protein antikor kokteylleriyle eşzamanlı uygulanabilmesi sayesinde aynı doku kesiti üzerinden uzamsal transkriptomik ve uzamsal proteomik verilerinin birlikte elde edilmesine olanak sağlamaktadır¹⁶.

  3.2 Görüntüleme Tabanlı Yöntemler: Floresan In Situ Hibridizasyon ve In Situ Dizileme

Görüntüleme tabanlı uzamsal transkriptomik platformları, floresan etiketli tamamlayıcı problar aracılığıyla hedef mRNA transkriptlerinin doku üzerinde in situ hibridizasyonuna ve elde edilen sinyallerin yüksek çözünürlüklü mikroskop ile nitelendirilmesine dayanmaktadır^9,17. Temelleri 1960’ların sonlarında nükleik asitlerin tamamlayıcı problarla işaretlenmesine dayanan in situ hibridizasyon (ISH) yaklaşımları, ilk olarak Drosophila embriyolarında doku ve organizma düzeyinde uygulanmış ancak uzun süre kalitatif düzeyde kalmıştır⁹. Tek molekül floresan in situ hibridizasyonun (smFISH) geliştirilmesiyle her transkript mikroskop altında tekil bir floresan difraksiyon noktası olarak çözümlenebilir hale gelmiş ve kantitatif ölçüm olanağı sağlanmıştır¹⁸. Güncel görüntüleme temelli uzamsal transkriptomik yöntemleri temel olarak ISH/FISH tabanlı ve in situ dizileme (ISS) tabanlı platformlar olmak üzere iki ana kategori altında incelenmektedir^9,19. 

    3.2.1 Floresan In Situ Hibridizasyon (FISH) Temelli Teknolojiler ve Hata Düzeltme Stratejileri

Tek molekül düzeyinde transkriptom profillemesi sağlayan seqFISH, seqFISH+ ve MERFISH gibi görüntüleme tabanlı uzamsal yöntemler, smFISH protokolünü ardışık çoklu hibridizasyon turlarıyla birleştiren temel platformlardır^17,20,21. Binlerce bağımsız geni farklı floroforlarla aynı anda eşleştirmenin optik kırınım sınırlarına takılması, seqFISH platformunda zamansal florofor barkodlama stratejisinin doğmasını sağlamıştır²⁰. Bu yaklaşımda hedef mRNA bölgeleri her turda farklı bir florofor ile hibridize edilmekte ve sinyalin zamansal dizilimi ilgili transkript türünü doğrudan tanımlamaktadır²⁰. Ne var ki transkript yoğunluğu yüksek örneklerde sinyallerin üst üste binmesini ifade eden optik kalabalıklaşma (optical crowding), yöntemin çözünürlük limitini zorlayan ve tespit kapasitesini düşüren en belirgin teknik kısıt olarak kalmıştır (Şekil 5)^20,21.

Optik kalabalıklaşma engelini aşmak üzere kurgulanan seqFISH+, birincil hedefleme problarını ikincil floresan probların bağlanabileceği çoklu bölgeler barındıracak biçimde yeniden tasarlamıştır²¹. Sistem, 60 sözde renk (pseudocolor) ve 20 ayrı hibridizasyon turundan faydalanarak her görüntüleme penceresinde transkript havuzunun yalnızca küçük bir fraksiyonunun ışıma yapmasını sağlar; bu strateji tek bir hücrede 10.000’e yakın genin çözümlenmesini mümkün kılarak yöntemin gen kapsama alanını dramatik ölçüde genişletmiştir²¹. Buna karşın, protokolün uygulama süresini uzatmakta, doku bütünlüğünün korunmasını zorlaştırmakta ve yüksek reaktif tüketimine yol açmaktadır^9,21. 

Şekil 5. seqFISH+ yönteminde sözde renk kodlaması ile optik kalabalıklaşmanın engellenmesi. Birincil hedefleme problarının ikincil floresan problarla ardışık 20 tur ve 60 sözde renk kombinasyonu üzerinden eşleşmesi, transkriptlerin seyreltik alt gruplar halinde ışıması sağlanarak subselüler çözünürlükte 10.000 genin haritalanma mekanizması şematize edilmiştir. mRNA: Messenger RNA, seqFISH: Sequential fluorescence in situ hybridization²¹.

Çoğullanmış hataya dayanıklı floresan in situ hibritleme (MERFISH) yaklaşımında ise ardışık hibridizasyon turları ikili kodlama matrisleri üzerinden tasarlanmaktadır¹⁷. Döngü sayısı arttıkça optik okuma hatalarının kümülatif olarak katlanması riskine karşı, Şekil 6’da gösterildiği gibi sisteme Hamming mesafesine dayalı hata tespit ve düzeltme algoritmaları entegre edilmiştir¹⁷. Bu matematiksel denetim, tekil sinyal kayıplarında veya hatalı floresan ışımalarında da sistemin beklenen kod desenini yeniden kurmasıanı sağlayarak yanlış pozitif oranını asgari düzeye indirir¹⁹. Yöntemin temel dezavantajı ise kullanılan katı hata düzeltme matrislerinin, teorik barkod kapasitesini sınırlandırarak seqFISH+ gibi yaklaşımlara kıyasla hedeflenebilecek gen çeşitliliğini sınırlandırmasıdır^9,17.

Şekil 6. MERFISH teknolojisinde hata toleranslı ikili kodlama ve ardışık hibridizasyon mekanizması. Hedef transkriptlere bağlanan kodlayıcı probların ikili matris sistemi (Hamming mesafesi) ile tanımlanması ve ardışık floresan hibridizasyon döngüleriyle optik okuma hatalarının matematiksel olarak düzeltme süreci gösterilmiştir. MERFISH: Multiplexed error-robust fluorescence in situ hybridization, smFISH: Single-molecule fluorescence in situ hybridization¹⁷.

Geleneksel FISH protokollerinde karşılaşılan dar doku alanı ve mikroskop altında saatler süren tarama kısıtlarını gidermek amacıyla geliştirilen EEL FISH (enhanced electric FISH), doku içindeki mRNA moleküllerini lam yüzeyine elektroforetik kuvvetle transfer etmektedir²². Bu transfer z-ekseni derinliğini ortadan kaldırarak sinyal şiddetini maksimize eder, optik saçılmayı engeller ve geniş doku alanlarının çok daha hızlı taranmasına zemin hazırlamaktadır²². Yöntem hız ve alan avantajı sunsa da elektroforez aşamasında mRNA moleküllerinin yanal (lateral) difüzyona uğrama riski, hücre içi alt-bölgesel lokalizasyon çözünürlüğünde kısmi kayıplara neden olabilmektedir²². 

Kalın dokularda çoklu hedeflerin uzamsal olarak incelenmesini amaçlayan EASI-FISH, iteratif FISH yaklaşımıyla kalın doku kesitlerinde moleküler organizasyonu çözümlemeye yönelik geliştirilmiştir^23,24. Bu teknikler, 300 µm’ye varan kalın doku bloklarında hücrelerin doğal mikroçevrelerini ve doku mimarisini bozmadan üç boyutlu transkript haritalaması çıkarma kabiliyeti kazandırmaktadır²³. Ancak doku genişletme kimyasının karmaşıklığı, mikroskop odaklama mekanizmalarına binen hesaplama yükü ve kalın kesitlerde ışığın doku içi saçılımından kaynaklanan sinyal-gürültü oran düşüşleri, bu 3B yöntemlerin pratik optimizasyonunu oldukça zahmetli kılmaktadır^23,24.

    3.2.2 In Situ Dizileme (ISS) Yaklaşımları ve Sinyal Amplifikasyonu

In situ dizileme yöntemleri, doğrudan gen spesifik floresan probların hibridizasyonunu izlemek yerine doku içinde çoğaltılmış cDNA moleküllerinin nükleotit dizilimlerini mikroskopi altında ardışık olarak okumaktadır¹⁹. Bu yöntemde hedef mRNA dizileri kilit (padlock) probları ile daireselleşmekte ve yuvarlanan çember amplifikasyonu (Rolling Circle Amplification – RCA) aracılığıyla yüzlerce kopyadan oluşan mikron altı DNA nanokürelerine (nanoball) dönüştürülmektedir¹⁹. Amplifiye edilen bu yapılar doku içi uzamsal koordinatlarını korurken, her dizileme turunda bağlanan floresan işaretli sorgu nükleotitleri optik olarak kaydedilmektedir¹⁹.

İlk ticari ISS uygulaması olan Cartana platformunda hedefli gen panellerine yönelik tek baz sorgulaması uygulanırken, floresan in situ dizileme (FISSEQ) ve genişleme mikroskopisi ile entegre ExSeq yöntemlerinde hedefsiz transkriptomik profilleme yapılmaktadır^19,25,26. Üç boyutlu doku bloklarında çalışan STARmap platformunda ise ligasyon tabanlı hata azaltma stratejileri (SEDAL) kullanılarak dizileme doğruluğu desteklenmektedir (Şekil 7)²⁷. 

Şekil 7. STARmap platformunda doku içi amplifikasyon ve SEDAL dizileme mekanizması. SNAIL problarının doku içinde mRNA’ya bağlanıp daireselleşmesi, yuvarlanan çember amplifikasyonu (RCA) ile DNA nanokürelerinin (amplikonların) oluşturulması ve SEDAL yöntemiyle iki baz sorgulu ardışık floresan ligasyon dizilemesinin gerçekleştirilmesi şematize edilmiştir. 3D: Three-dimensional, DNA: Deoxyribonucleic acid, mRNA: Messenger RNA, RCA: Rolling circle amplification, SEDAL: Sequencing with error-reduction by dynamic annealing and ligation, SNAIL: Specific amplification of nucleic acids via intramolecular ligation²⁷.

   3.2.3 Görüntüleme Tabanlı Sistemlerin Karşılaştırmalı Performansı ve Teknik Sınırlılıkları

Hem ISH/FISH hem de ISS sistemleri hücre içi ve subselüler düzeyde uzamsal çözünürlük sağlamaları bakımından yüksek çözünürlüklü histopatolojik analizlere imkân tanımaktadır. Bununla birlikte iki grup arasında teknik performans farklılıkları mevcuttur^9,17,19.

Görüntüleme tabanlı sistemlerin performans parametreleri değerlendirildiğinde, FISH ve ISS yaklaşımları arasında tespit hassasiyeti, optik gereksinimler ve veri yönetim süreçleri bakımından belirgin teknik farklılıkların bulunduğu görülmektedir⁹. FISH temelli platformlar tekil mRNA moleküllerini florofor konjuge problarla doğrudan eşleştirebildiğinden transkript yakalama duyarlılıkları oldukça yüksek seviyelerde seyretmektedir^9,17. Buna karşılık ISS sistemlerinde hedeflerin tespiti enzimatik RCA reaksiyonunun başarısına bağlı kalmakta, amplifiye edilemeyen transkriptlerin analiz dışı kalması nedeniyle tespit verimliliği görece daha düşük kalabilmektedir^9,19. 

Optik gereksinimler açısından ele alındığında, ISS yöntemlerinde RCA reaksiyonu sonucu üretilen yoğun floresan sinyali mikroskopta daha düşük büyütmelerle çalışılmasına ve dolayısıyla daha geniş doku alanlarının taramasına olanak tanımaktadır¹⁹. FISH protokollerinde ise tekil molekül sinyallerinin zayıflığı sebebiyle yüksek büyütmeli immersiyon objektiflerinin kullanımı zorunlu hale gelmekte, bu durum incelenebilen doku yüzey alanını sınırlandırmaktadır9. Bununla birlikte, çok sayıda ardışık hibridizasyon, ligasyon ve yıkama döngüsü gerektiren her iki teknoloji de günler mertebesine varabilen mikroskopi sürelerine ihtiyaç duymakta ve yüzlerce gigabayt ila terabayt ölçeğinde ham görüntü verisi üretmektedir^9,19. İncelenen gen paneli genişledikçe hibridizasyon turlarının çoğalması, kümülatif teknik hata olasılığı ile hedeflenen transkriptom derinliği arasında metodolojik bir dengenin gözetilmesini zorunlu kılmaktadır⁹. 

4. Dizileme Tabanlı Yöntemlerin Karşılaştırmalı Performans Parametreleri

Farklı dizileme tabanlı uzamsal transkriptomik platformlarının çözünürlük limitleri, yakalama alanları, bağıl transkript duyarlılıkları ve doku içi difüzyon parametreleri Tablo 1’de karşılaştırmalı olarak özetlenmiştir². 

Tablo 1. Dizileme tabanlı başlıca uzamsal transkriptomik yöntemlerinin moleküler yakalama sistemleri, uzamsal çözünürlük ölçekleri, doku yüzey alanı kapasiteleri, transkriptomik duyarlılıkları ve lateral difüzyon eğilimleri özetlenmiştir. DNB: DNA Nanoball, FF: Fresh-frozen (Taze dondurulmuş), RNA: Ribonucleic acid, UMI: Unique Molecular Identifier (Benzersiz moleküler tanımlayıcı)².

Dizileme tabanlı yöntemlerde geçirgenleştirme süresinin optimizasyonu kritik bir aşamayı oluşturmaktadır². Aşırı geçirgenleştirme durumunda mRNA moleküllerinin doku düzleminde yatay olarak yayılması gözlenmekte, bu durum uzamsal bilginin bulanıklaşmasına yol açmaktadır^2,9. Yetersiz geçirgenleştirme ise transkript yakalama oranını ve kütüphane verimliliğini düşürmektedir².

5. Biyoinformatik Veri İşleme ve Hesaplamalı Analiz Yöntemleri

Uzamsal transkriptomik platformlarından elde edilen veriler; ham görüntü hizalama, kalite kontrolü, matris normalizasyonu ve doku mimarisini aydınlatan ileri istatistiksel modelleme boru hatlarını içermektedir⁷.

  5.1 Kalite Kontrolü, Normalizasyon ve Boyut İndirgeme

Ham okumaların kalite kontrolünde, doku dışı alanda kalan arka plan noktacıklar filtrelenmekte; hücre başına düşen UMI sayıları ve mitokondriyal gen oranları incelenmektedir^3,7. Veri setlerindeki teknik varyansın ve sıfır enflasyonunun (zero-inflation) dengelenmesi amacıyla SCTransform veya bayesyen normalizasyon protokolleri tercih edilmektedir^7,28. Boyut indirgeme süreçlerinde temel bileşenler analizi (Principal Component Analysis – PCA) gerçekleştirilmekte, görselleştirme amacıyla Uniform Manifold Approximation and Projection (UMAP) ve t-Distributed Stochastic Neighbor Embedding (t-SNE) projeksiyonları uygulanmaktadır^3,7.

  5.2 Hücre Tipi Dekonvolüsyonu ve scRNA-seq Entegrasyonu

Çözünürlüğü tek hücre çapının üzerinde olan katı faz dizileme platformlarında her bir koordinat birden fazla hücre tipinin transkript karışımını barındırabilmektedir^1,2. Bu karmaşıklığın çözülmesi amacıyla, eşleştirilmiş scRNA-seq referans profillerinden yararlanan denetimli olasılıksal dekonvolüsyon algoritmaları geliştirilmiştir⁷.

Örneğin Cell2location, negatif binomiyal dağılım çerçevesinde hiyerarşik bir Bayes modeli kurarak teknik gürültüyü arındırmak ve her bir uzamsal noktadaki hücre tiplerinin mutlak bolluğunu tahmin etmektedir¹¹. Robust Cell Type Decomposition (RCTD), platformlar arası teknik farklılıkları modüle ederek hücre karışımlarını ayrıştırmaktadır²⁹. Seurat kütüphanesinde uygulanan çok modlu transfer modelleri (anchoring) ve CARD (Spatially Constrained Deconvolution) ise uzamsal komşuluk bağıntılarını kısıtlayıcı parametre olarak dahil ederek hücre tipi haritalamasını optimize etmektedir^2,7,30,31.

  5.3 Uzamsal Değişken Genlerin (SVG) Modellenmesi

Hücrelerin morfolojik yerleşimine paralel olarak mekânsal değişkenlik sergileyen genlerin (Spatially Variable Genes – SVG) saptanması, doku alanlarının sınırlarını belirlemede temel basamaktır⁷. SpatialDE algoritması, gen ifadesindeki varyansı uzamsal koordinatlara bağlı olan ve olmayan bileşenlere ayırmak için Gauss süreç regresyonundan (Gaussian Process Regression) yararlanmaktadır³².

Spatial Pattern Recognition via Kernels (SPARK) yöntemi ise aşırı basıklık ve Poisson varyans özelliklerini doğrudan modelleyerek istatistiksel gücü artırmakta ve non-parametrik çekirdek fonksiyonları üzerinden uzamsal desenleri araştırmaktadır³³. 

5.4 Hücre-Hücre İletişimi ve Mikromimari Niş Ağları

Doku içi hücrelerin birbirleriyle olan fonksiyonel etkileşimleri, ligand ve reseptör genlerinin mekânsal birlikteliklerine dayalı olarak modellenmektedir^1,7. CellChat, ligand–reseptör temelli hücreler arası iletişim olasılıklarını modelleyebilir ve uzamsal analizlerde mesafe ya da temas kısıtları kullanıcı tarafından tanımlanabilir; Giotto ise uzamsal komşuluk ağları ve ligand–reseptör analizleri için ayrı iş akışları sunar. Bu araçların skorları olası etkileşimleri önceliklendirmeye yardımcı olur, ancak biyolojik sinyalleşmenin doğrudan kanıtı değildir ^34,35,47. Multiview Intercellular SpaTial modeling framework (MISTy) gibi çoklu görünüm modelleme araçları ise hücre içi regülasyonlar ile yerel ve geniş ölçekli mikroçevre etkilerini birbirinden ayırabilmektedir³⁶.

6. Yapay Zekâ ve Temel Modeller Çağında Tek Hücreli ve Uzamsal Transkriptomik

  6.1 Derin Öğrenme Mimarileri ve Tek Hücre Temel Modelleri

scRNA-seq ve uzamsal transkriptomik veri setlerinin ölçek ve çoklu omik parametreleri açısından büyümesi, veri analizinde yapay zekâ ve derin öğrenme algoritmalarının kullanımını ön plana çıkarmıştır1. Doğal dil işleme ve görüntü transformatörlerinin (Vision Transformers) biyolojik verilere uygulanması, hücrelerin transkripsiyon durumlarının yüksek boyutlu gizil alanlarda temsil edilmesini kolaylaştırmıştır^1,,37. Denetimli derin öğrenme modelleri doku kesitlerindeki ince histopatolojik ve uzamsal desenlerden hasta tedavi yanıtlarını tahmin edebilir, denetimsiz yöntemler manuel yığın etkisi düzeltmesine gerek kalmaksızın heterojen veri setlerindeki ortak biyolojik eksenleri ayrıştırabilmektedir^1,37.

Son dönemde araştırmalar, büyük miktarda etiketlenmemiş biyolojik veri üzerinde önceden eğitilen ve aşağı akış görevler için ortak bir çatı sunan tek hücre temel modelleri (foundation models) üzerine yoğunlaşmıştır^1,37. scGPT, Geneformer ve scBERT gibi transformer tabanlı modeller farklı doku, platform ve deneysel koşullardan gelen milyonlarca hücre profilini birleşik bir gömme alanında (embedding space) haritalamak üzere üretilmektedir^37-39. Bu temsil modelleri sayesinde hücre durumlarının tespiti, referans verilen hücre tipi veya aktivasyon durumunun etiketsiz veri setlerine aktarılması sağlanabilmektedir (Şekil 8)^1,37. Aynı zamanda bu temsil modelleriyle, gen delesyonu ya da ilaç maruziyeti gibi biyolojik pertürbasyonların hücre üzerindeki transkripsiyonel yansımalarının in silico olarak tahmin edilmesi mümkün kılınmaktadır^1,37,38.

Şekil 8 . Tek hücreli ve uzamsal transkriptomik yapay zekâ ve temel modellerin iş akışı ve analitik uygulama alanları. a. Büyük ölçekli tek hücreli ve uzamsal çoklu omik verilerinin derin öğrenme mimarileriyle bütünleştirme süreci. b. Milyonlarca etiketlenmemiş transkriptom profili üzerinde önceden eğitilmiş temel modellerin oluşturduğu ortak gizil temsil alanı. c. Temel modellerden türetilen aşağı akış uygulamaları: hücre tipi ve durum transferi, veri entegrasyonu, mekânsal mikroçevre tahmini ve in silico pertürbasyon modellemesi. scRNA-seq: Single-cell RNA sequencing, ST: Spatial Transcriptomics, GNN: Graph Neural Network¹.

 6.2 Uzamsal Farkındalığa Sahip Temel Modeller ve In Silico Pertürbasyon Tahminleri

scRNA-seq tabanlı temel modeller hızla genişlerken, uzamsal transkriptomik için güncelleştirilebilir temel modellerin geliştirilmesi organize edilmiş büyük ölçekli mekânsal atlasların sınırlılığı nedeniyle daha yavaş ilerlemektedir1. Bununla birlikte, tek hücre transkriptom verilerini doku mimarisinin sunduğu hücresel komşuluk bilgisi ile eğiten çok modüllü mimariler bildirilmektedir^1,40. Bu modellerde, scRNA-seq profillerinden çok hücreli mikroçevre nişlerini tahmin edebilen veya prob tabanlı hedefli ST panellerindeki eksik transkriptomik katmanları tamamlayan uzamsal farkındalık kodlayıcı-kod çözücü sistemleri kullanılmaktadır^1,40.

Mekânsal temel modellerin sunduğu önemli olanaklardan biri, hücrelerin içinde bulundukları mikromimari nişten aldıkları sinyallerin in silico pertürbasyon simülasyonları ile modellenmesidir¹. Belirli bir immün hücrenin veya stroma hücresinin mikroçevreden çıkarılması ya da komşu hücrelerin ligand ekspresyonunun sanal olarak baskılanması durumunda hücrenin transkripsiyonel durumunda oluşabilecek değişiklikler hesaplamalı olarak test edilebilmektedir^1,37. Bu simülasyon yeteneğinin, kök hücre nişlerindeki morfogenetik gradyanların ve tümör immün mikroçevresindeki immünsüpresif ağların nedensel mekanizmalarının aydınlatılmasına katkı sağlayabileceği düşünülmektedir^1,40. 

6.3 Model Yorumlanabilirliği, Biyolojik Güvenilirlik ve Halüsinasyon Riski

Yapay zekâ modellerinin transkriptomik analizlerde sergilediği yüksek kestirim gücüne karşın, bu mimarilerin biyolojik olarak yorumlanabilirliği ve klinik güvenilirliği önemli tartışmaları beraberinde getirmektedir. Derin sinir ağlarının hangi gen regülasyon modüllerine, mekânsal ekotiplere veya hücre-hücre etkileşim kurallarına dayanarak tahmin yürüttüğünü açıklamak karmaşık bir problem olmaya devam etmektedir^1,36. 

Ayrıca temel modellerin, eğitim setlerinde aşırı temsil edilen doku veya hastalık tiplerine karşı biyolojik yanlılık sergileyebileceği eğitim verisinde az temsil edilen nadir hücre popülasyonlarında ise gerçek biyolojik varyansı yakalayamadığı gösterilmektedir¹. Özellikle üretken modellerin, günlük hayatta yapay zekâ halüsinasyonu olarak da bilinen ve biyolojik gerçekliği bulunmayan sahte gen ifadeleri ya da uzamsal desenler türetmesi en kritik risk faktörlerinden biridir¹. 

Bu nedenle, temel modellerin bağımsız, yüksek kaliteli referans (benchmark) veri setleri ile sistematik olarak kıyaslanması model çıkarımlarının hücre biyolojisi kurallarıyla çapraz doğrulanması ve klinik ortamlarda kullanılmadan önce yorumlanabilir yapay zekâ (XAI) araçlarıyla denetlenmesi zorunlu görülmektedir^1,7,36.

7. Biyomedikal Araştırmalarda Uzamsal Transkriptomik Uygulamaları

Uzamsal transkriptomik, hücrelerin histopatolojik bağlamdaki organizasyonunu aydınlatması sebebiyle onkoloji, sinirbilim ve gelişim biyolojisi alanlarında geniş kullanım alanı bulmuştur^1,3,10.

  7.1 Tümör Mikroçevresi ve İmmün İnfiltrasyon Dinamikleri

Kanser dokusundaki genomik heterojenliğin ve neoplastik klonların anatomik dağılımının incelenmesinde uzamsal yaklaşımlar kilit rol oynamaktadır^10,41. Tümör merkezinde hipoksik bölgelerin sınırları belirlenmekte, tümör-stroma ara yüzünde T hücrelerinin infiltrasyon durumu ve immünsüpresif myeloid hücre nişleri haritalanmaktadır (Şekil 9)^1,41. Yapılan çalışmalarda, immün kontrol noktası inhibitörlerine yanıtın yalnızca hücre varlığıyla değil, efektör lenfositlerin tümör parankim ile olan fiziksel mesafesiyle ilişkili olduğu gösterilmiştir^1,41. 

Şekil 9. İnsan meme kanseri dokusunda uzamsal transkriptomik ile tümör-stroma ve immün mikroçevre mimarisinin çözümlenmesi. Meme kanseri doku kesitlerinde tek hücre RNA dizileme (scRNA-seq) referans profilleri kullanılarak 10x Visium noktacıkları üzerinde gerçekleştirilen hücresel dekonvolüsyon analizi gösterilmiştir. a. İncelenen tümör dokusunun histopatolojik H&E boyama görüntüsü ve patolojik bölge sınıflandırması. b. Dokunun morfolojik koordinatları üzerinde neoplastik epitel hücrelerinin, kanserle ilişkili fibroblast alt tiplerinin (iCAF ve myCAF) ve stromaya infiltre olan immün hücrelerin (T lenfositler ve makrofajlar) uzamsal bolluk ısı dağılım haritaları verilmiştir. Analizler, immün hücrelerin tümör merkezinden ziyade stroma ara yüzünde ve peritümöral alanlarda kümelendiğini ortaya koymaktadır. CAFs: Cancer-associated fibroblasts (Kanserle ilişkili fibroblastlar), DCIS: Ductal carcinoma in situ, H&E: Hematoxylin and eosin, PVL: Perivascular-like cells, scRNA-seq: Single-cell RNA sequencing, TILs: Tumor-infiltrating lymphocytes ( Tümöre infiltre olan lenfositler)⁴¹.

 7.2 Nörobiyoloji ve Karmaşık Beyin Katmanlarının Haritalanması

Santral sinir sistemi, yüksek hücresel çeşitlilik ve katı bir katmanlaşma hiyerarşisi sergilemektedir^17,42. MERFISH ve Stereo-seq uygulamalarıyla kemirgen ve insan serebral korteksindeki nöronal alt tiplerin lamina bazlı dağılımı ortaya konmuştur^14,42. Alzheimer hastalığı modellerinde gerçekleştirilen uzamsal transkriptomik profillemelerde, amiloid-beta plaklarının hemen çevresindeki mikroglial hücrelerde aktive olan erken enflamatuar gen modülleri mekânsal olarak saptanmıştır⁴³.

  7.3 Gelişim Biyolojisi ve Embriyonik Organogenez Atlasları

Embriyonik gelişim ve organogenez süreçleri; hücrelerin katı bir uzamsal-zamansal hiyerarşi içerisinde çoğaldığı, morfojen gradyanlarını takip ederek göç ettiği ve komşu doku katmanlarıyla dinamik etkileşime girerek farklılaştığı son derece koordine mekanizmalara dayanmaktadır^1,14. Geleneksel embriyoloji yaklaşımları morfolojik yapıların mikroskobik takibini sağlarken, dökme veya tek hücreli transkriptomik yöntemleri bu morfolojiyi yönlendiren hücre içi sinyal yolaklarını doku düzleminden kopararak sunabilmiştir^1,4,14. Uzamsal transkriptomik teknolojilerinin sunduğu geniş doku alanı ve subselüler çözünürlük kabiliyeti, tüm bir embriyonun veya gelişmekte olan organ primordiyumlarının hücresel kader haritalarının intakt mimari üzerinde çıkarılmasına olanak tanımaktadır^2,14.

Bu alandaki en kapsamlı uzamsal çalışmalardan biri olan Fare Organogenezi Uzamsal-Zamansal Transkriptomik Atlası (Mouse Organogenesis Spatiotemporal Transcriptomic Atlas – MOSTA), Stereo-seq platformunun subselüler çözünürlüklü DNA nanoküre çipleri kullanılarak gerçekleştirilmiştir¹⁴. Fare embriyogenezinin kritik evrelerini kapsayacak şekilde yürütülen bu atlas çalışmasında, tüm embriyo kesitleri boyunca milyonlarca uzamsal koordinat haritalanmış ve organogenez sırasında şekillenen hücresel soy hatları taranmıştır¹⁴. Bu atlas, fare organogenezinin farklı evrelerinde gen ifadesinin uzamsal-zamansal dağılımını ve hücresel heterojenliği haritalamıştır; nöral tüp kapanması, kardiyak odacık matürasyonu veya belirli parakrin gradyanlara ilişkin her bir özgül çıkarım ise ilgili sonuç ve şekillerle ayrıca desteklenmelidir ¹⁴.

Embriyonik organogenezin uzamsal boyutta çözümlenmesi, gelişimsel biyolojide klasik hücre tipi anotasyonlarının ötesine geçerek hücrelerin komşuluk içerisinde fonksiyonel kimlik kazandığını açıklamaktadır^1,14. Bu modeller aynı zamanda konjenital anomalilerin, nörogelişimsel bozuklukların ve organogenez sırasındaki hatalı hücre göçlerinin moleküler kökenlerinin aydınlatılmasında temel bir referans veri tabanı sunmaktadır^1,14.

8. Mevcut Sınırlılıklar ve Gelecek Perspektifi

Uzamsal transkriptomik teknolojilerindeki ilerlemelere rağmen, tam transkriptom düzeyinde hücre içi çözünürlüğe ulaşılması sırasında transkript yakalama verimliliğinin düşmesi halen önemli bir teknik kısıttır^1,2. Ayrıca yüksek çözünürlüklü görüntüleme ve derin dizileme süreçlerinin gerektirdiği hesaplama yükü ile depolama maliyetleri veri analizini zorlaştırmaktadır^7,45.

Gelecekte, transkriptom verilerinin epigenomik işaretler (Spatial ATAC-seq) ve proteomik verilerle tekil kesitlerde eşzamanlı olarak bütünleştirildiği çoklu omik sistemlerin yaygınlaşması beklenmektedir^44,45. Bu gelişmelerin, gelişimsel biyolojide hücre kaderi haritalarının ve klinik patolojide moleküler tanı süreçlerinin hassasiyetine katkı sağlayacağı öngörülmektedir^1,44,45.

9. Sonuç

Transkriptomik heterojenliği doku mimarisi ve konum bilgisiyle bütünleştirerek moleküler biyoloji ve doku patolojisinde önemli analitik olanaklar sağlamıştır. Bu yaklaşımlar, tek hücre dizilemesi için gerekli doku ayrıştırmasına bağlı bazı hücre kaybı ve ayrıştırma kaynaklı transkripsiyonel artefaktları azaltmaya yardımcı olabilir; ancak doku hazırlama, RNA bütünlüğü, geçirgenleştirme, yakalama ve görüntüleme basamaklarından kaynaklanan artefaktları bütünüyle ortadan kaldırmaz.

Katı faz barkodlama ve yeni nesil dizileme temelli platformlar tüm transkriptomu kapsayan tarafsız profilleme olanağı sunarken; smFISH ve in situ dizileme ilkelerine dayanan görüntüleme temelli yaklaşımlar subselüler çözünürlük ve yüksek tek molekül tespit verimliliği sağlamaktadır. Bu iki ana teknolojik sınıf arasındaki çözünürlük, doku alanı genişliği ve transkript yakalama duyarlılığı dengeleri, incelenen biyolojik sorunun kapsamına göre yöntem seçimini şekillendirmektedir. Çok hücreli karışımların çözümlenmesinde kullanılan olasılıksal dekonvolüsyon modelleri, uzamsal değişken gen analizleri ve ligand-reseptör sinyal haritalamaları, üretilen yüksek boyutlu verilerin biyolojik çıkarımlara dönüştürülmesinde kritik rol oynamaktadır.

Yapay zekâ ve derin öğrenme temelli modellerin bu analiz iş akışlarına entegrasyonu, multimodal veri birleştirme, hücre tipi transferi ve in silico pertürbasyon simülasyonları gibi daha önce metodolojik olarak sınırlı kalan analitik alanların önünü açmaktadır. Ancak üretken modellerin biyolojik geçerliliği, halüsinasyon riskleri ve klinik güvenilirlik için zorunlu olan model yorumlanabilirliği konuları araştırmaların odak noktası olmaya devam etmektedir. Gelecek perspektifinde; uzamsal transkriptom verilerinin epigenomik ve proteomik katmanlarla eşzamanlı haritalandığı çoklu omik platformlarının gelişimi ile hesaplama maliyetlerinin düşürülmesi, gelişim biyolojisinden tümör immünolojisine kadar pek çok alanda doku düzeyindeki hücresel mekanizmaların daha kapsamlı anlaşılmasına katkı sağlayacaktır.

Kaynakça

1. Gulati, G. S., D’Silva, J. P., Liu, Y., Wang, L., & Newman, A. M. (2025). Profiling cell identity and tissue architecture with single-cell and spatial transcriptomics. Nature Reviews Molecular Cell Biology, 26(1), 11–31. https://doi.org/10.1038/s41580-024-00768-2

2. You, Y., Fu, Y., Li, L., Zhang, Z., Jia, S., Lu, S., Ren, W., Liu, Y., Xu, Y., Liu, X., Jiang, F., Peng, G., Kumar, A. S., Ritchie, M. E., Liu, X., & Tian, L. (2024). Systematic comparison of sequencing-based spatial transcriptomic methods. Nature Methods, 21(9), 1743–1754. https://doi.org/10.1038/s41592-024-02325-3
3. Williams, C. G., Lee, H. J., Asatsuma, T., Vento-Tormo, R., & Haque, A. (2022). An introduction to spatial transcriptomics for biomedical research. Genome Medicine, 14(1), 68. https://doi.org/10.1186/s13073-022-01075-1
4. Svensson, V., Vento-Tormo, R., & Teichmann, S. A. (2018). Exponential scaling of single-cell RNA-seq in the past decade. Nature Protocols, 13(4), 599–604. https://doi.org/10.1038/nprot.2017.149
5. Chen, T. Y., You, L., Hardillo, J. A. U., & Chien, M. P. (2023). Spatial transcriptomic technologies. Cells, 12(16), 2042. https://doi.org/10.3390/cells12162042
6. Ståhl, P. L., Salmén, F., Vickovic, S., Lundmark, A., Navarro, J. F., Magnusson, J., Giacomello, S., Asp, M., Westholm, J. O., Huss, M., Mollbrink, A., Linnarsson, S., Codeluppi, S., Borg, Å., Pontén, F., Costea, P. I., Sahlén, P., Mulder, J., Bergmann, O., … Frisén, J. (2016). Visualization and analysis of gene expression in tissue sections by spatial transcriptomics. Science, 353(6294), 78–82. https://doi.org/10.1126/science.aaf2403
   
7. Fang, S., Chen, B., Zhang, Y., Sun, H., Liu, L., Liu, S., Li, Y., & Xu, X. (2023). Computational approaches and challenges in spatial transcriptomics. Genomics, Proteomics & Bioinformatics, 21(1), 24–47. https://doi.org/10.1016/j.gpb.2022.10.001
8. van den Brink, S. C., Sage, F., Vértesy, Á., Spanjaard, B., Peterson-Maduro, J., Baron, C. S., Robin, C., & van Oudenaarden, A. (2017). Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations. Nature Methods, 14(10), 935–936. https://doi.org/10.1038/nmeth.4437
9. Moses, L., & Pachter, L. (2022). Museum of spatial transcriptomics. Nature Methods, 19(5), 534–546. https://doi.org/10.1038/s41592-022-01409-2
10. Rao, A., Barkley, D., França, G. S., & Yanai, I. (2021). Exploring tissue architecture using spatial transcriptomics. Nature, 596(7871), 211–220. https://doi.org/10.1038/s41586-021-03634-9
11. Kleshchevnikov, V., Shmatko, A., Dann, E., Aivazidis, A., King, H. W., Li, T., Elmentaite, R., Lomakin, A., Kedlian, V., Gayoso, A., Jain, M. S., Park, J. S., Ramona, L., Tuck, E., Arutyunyan, A., Vento-Tormo, R., Gerstung, M., James, L., Stegle, O., & Bayraktar, O. A. (2022). Cell2location maps fine-grained cell types in spatial transcriptomics. Nature Biotechnology, 40(5), 661–671. https://doi.org/10.1038/s41587-021-01139-4
12. Rodriques, S. G., Stickels, R. R., Goeva, A., Martin, C. A., Murray, E., Vanderburg, C. R., Wohlwend, J., Chen, F., & Macosko, E. Z. (2019). Slide-seq: A scalable technology for measuring genome-wide expression at high spatial resolution. Science, 363(6434), 1463–1467. https://doi.org/10.1126/science.aaw1219
13. Stickels, R. R., Murray, E., Kumar, P., Li, J., Marshall, J. L., Di Bella, D. J., Arlotta, P., Macosko, E. Z., & Chen, F. (2021). Highly sensitive spatial transcriptomics at near-cellular resolution with Slide-seqV2. Nature Biotechnology, 39(3), 313–319. https://doi.org/10.1038/s41587-020-0739-1
14. Chen, A., Liao, S., Cheng, M., Ma, K., Wu, L., Lai, Y., Qiu, X., Yang, J., Xu, J., Hao, S., Wang, X., Lu, H., Chen, X., Liu, X., Huang, X., Li, Z., Hong, Y., Jiang, Y., Peng, J., … Wang, J. (2022). Spatiotemporal transcriptomic atlas of mouse organogenesis using DNA nanoball-patterned arrays. Cell, 185(10), 1777–1792.e21. https://doi.org/10.1016/j.cell.2022.04.003
    
15. Cho, C. S., Xi, J., Si, Y., Park, S. R., Hsu, J. E., Kim, M., Jun, G., Kang, H. M., & Lee, J. H. (2021). Microscopic examination of spatial transcriptome using Seq-Scope. Cell, 184(13), 3559–3572.e22.https://doi.org/10.1016/j.cell.2021.05.010
16. Liu, Y., Yang, M., Deng, Y., Su, G., Enninful, A., Guo, C. C., Tebaldi, T., Zhang, D., Kim, D., Pei, Z., Barnes, M., Mahajan, S., & Fan, R. (2020). High-spatial-resolution multi-omics sequencing via deterministic barcoding in tissue. Cell, 183(6), 1665–1681.e18. https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.10.021
17. Chen, K. H., Boettiger, A. N., Moffitt, J. R., Wang, S., & Zhuang, X. (2015). Spatially resolved, highly multiplexed RNA profiling in single cells. Science, 348(6233), aaa6090. https://doi.org/10.1126/science.aaa6090
18. Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., & Singer, R. H. (1998). Visualization of single RNA transcripts in situ. Science, 280(5363), 585–590. https://doi.org/10.1126/science.280.5363.585
19. Ke, R., Mignardi, M., Pacureanu, A., Svedlund, J., Tammela, J., Nilson, H., Thelaus, J., Larsson, C., & Nilsson, M. (2013). In situ sequencing for RNA analysis in preserved tissue and cells. Nature Methods, 10(9), 857–860.https://doi.org/10.1038/nmeth.2563
20. Lubeck, E., Coskun, A. F., Zhiyentayev, T., Ahmad, M., & Cai, L. (2014). Single-cell in situ RNA profiling by sequential hybridization. Nature Methods, 11(4), 360–361. https://doi.org/10.1038/nmeth.2892
21. Eng, C.-H. L., Lawson, M., Zhu, Q., Dries, R., Koulena, N., Takei, Y., Yun, J., Cronin, C. J., Karp, C., Yuan, G.-C., & Cai, L. (2019). Transcriptome-scale super-resolved imaging in tissues by RNA seqFISH+. Nature, 568(7751), 235–239. https://doi.org/10.1038/s41586-019-1049-y
22. Borm, L. E., Mossi Albiach, A., Mannens, C. C. A., Janusauskas, J., Özgün, C., Fernández-García, D., Hodge, R., Castillo, F., Hedlund, E., Codeluppi, S., & Linnarsson, S. (2023). Scalable in situ single-cell profiling by electrophoretic capture of mRNA using EEL FISH. Nature Biotechnology, 41(2), 222–231. https://doi.org/10.1038/s41587-022-01455-3
23. Wang, Y., Eddison, M., Fleishman, G., Weigert, M., Xu, S., Wang, T., Rokicki, K., Goina, C., Henry, F. E., Lemire, A. L., Schmidt, U., Yang, H., Svoboda, K., Myers, E. W., Saalfeld, S., Korff, W., Sternson, S. M., & Tillberg, P. W. (2021). EASI-FISH for thick tissue defines lateral hypothalamus spatio-molecular organization. Cell, 184(26), 6361–6377.e24. https://doi.org/10.1016/j.cell.2021.11.024
24. He, S., Bhatt, R., Brown, C., Brown, E. A., Buhr, D. L., Chantranuvatana, K., Danaher, P., Dunaway, D., Garrison, R. G., Geiss, G., Gregory, M. T., Hoang, M. L., Khafizov, R., Killingbeck, E. E., Kim, D., Kim, T. K., Kim, Y., Klock, A., Korukonda, M., … Beechem, J. M. (2022). High-plex imaging of RNA and proteins at subcellular resolution in fixed tissue by spatial molecular imaging. Nature Biotechnology, 40(12), 1794–1806. https://doi.org/10.1038/s41587-022-01483-z
25. Lee, J. H., Daugharthy, E. R., Scheiman, J., Kalhor, R., Yang, J. L., Ferrante, T. C., Terry, R., Jeanty, S. S. F., Li, C., Amamoto, R., Peters, D. T., Turczyk, B. M., Marblestone, A. H., Inverso, S. A., Bernard, A., Mali, P., Rios, X., Aach, J., & Church, G. M. (2014). Highly multiplexed subcellular RNA sequencing in situ. Science, 343(6177), 1360–1363. https://doi.org/10.1126/science.1250212
26. Alon, S., Goodwin, D. R., Sinha, A., Wassie, A. T., Chen, F., Daugharthy, E. R., Bando, Y., Kajita, A., Xue, A. G., Marrett, K., Prior, R., Cui, Y., Payne, A. C., Yao, C.-C., Suk, H.-J., Wang, R., Yu, C.-C., Tillberg, P., Reginato, P., … Boyden, E. S. (2021). Expansion sequencing: Spatially precise in situ transcriptomics in intact biological systems. Science, 371(6528), eaax2656. https://doi.org/10.1126/science.aax2656
27. Wang, X., Allen, W. E., Wright, M. A., Sylwestrak, E. L., Samusik, N., Vesuna, S., Evans, K., Liu, C., Ramakrishnan, C., Liu, J., Nolan, G. P., Bava, F. A., & Deisseroth, K. (2018). Three-dimensional intact-tissue sequencing of single-cell spatial transcriptomics. Science, 361(6400), eaat5691. https://doi.org/10.1126/science.aat5691
28. Hafemeister, C., & Satija, R. (2019). Normalization and variance stabilization of single-cell RNA-seq data using regularized negative binomial regression. Genome Biology, 20(1), 296. https://doi.org/10.1186/s13059-019-1874-1
29. Cable, D. M., Murray, E., Zou, L. S., Goeva, A., Macosko, E. Z., Chen, F., & Irizarry, R. A. (2022). Robust decomposition of cell type mixtures in spatial transcriptomics. Nature Biotechnology, 40(4), 517–526. https://doi.org/10.1038/s41587-021-00830-w
30. Stuart, T., Butler, A., Hoffman, P., Hafemeister, C., Papalexi, E., Mauck, W. M., Hao, Y., Stoeckius, M., Smibert, P., & Satija, R. (2019). Comprehensive integration of single-cell data. Cell, 177(7), 1888–1902.e21. https://doi.org/10.1016/j.cell.2019.05.031
31. Ma, Y., & Zhou, X. (2022). Spatially informed cell-type deconvolution for spatial transcriptomics. Nature Biotechnology, 40(9), 1349–1359. https://doi.org/10.1038/s41587-022-01273-7
32. Svensson, V., Teichmann, S. A., & Stegle, O. (2018). SpatialDE: Identification of spatially variable genes. Nature Methods, 15(5), 343–346. https://doi.org/10.1038/nmeth.4636
33. Sun, S., Zhu, J., & Zhou, X. (2020). Statistical analysis of spatial expression patterns for spatially resolved transcriptomic studies. Nature Methods, 17(2), 193–200. https://doi.org/10.1038/s41592-019-0701-7
34. Jin, S., Guerrero-Juarez, C. F., Zhang, L., Chang, I., Ramos, R., Kuan, C.-H., Myung, P., Plikus, M. V., & Nie, Q. (2021). Inference and analysis of cell-cell communication using CellChat. Nature Communications, 12(1), 1088. https://doi.org/10.1038/s41467-021-21246-9
35. Dries, R., Zhu, Q., Dong, R., Eng, C.-H. L., Li, H., Liu, K., Fu, Y., Zhao, T., Sarkar, A., Bao, F., George, R. E., Pierson, N., Cai, L., & Yuan, G.-C. (2021). Giotto: A toolbox for integrative analysis and visualization of spatial expression data. Genome Biology, 22(1), 78. https://doi.org/10.1186/s13059-021-02286-2
36. Tanevski, J., Flores, R. O. R., Gabor, A., Schapiro, D., & Saez-Rodriguez, J. (2022). Explainable multiview framework for dissecting intercellular signaling from highly multiplexed spatial data. Genome Biology, 23(1), 97. https://doi.org/10.1186/s13059-022-02663-5
37. Cui, H., Wang, C., Maan, H., Pang, K., Luo, F., Duan, N., & Wang, B. (2024). scGPT: Toward building a foundation model for single-cell multi-omics using generative AI. Nature Methods, 21(8), 1470–1480. https://doi.org/10.1038/s41592-024-02201-0
38. Theodoris, C. V., Xiao, L., Chopra, A., Chaffin, M. D., Al Sayed, Z. R., Hill, M. C., Mantineo, H., Brydon, E. M., Zeng, Z., Liu, X. S., & Ellinor, P. T. (2023). Transfer learning enables predictions in network biology. Nature, 618(7965), 616–624. https://doi.org/10.1038/s41586-023-06139-9
39. Yang, F., Wang, W., Wang, F., Fang, Y., Tang, D., Huang, J., Lu, H., & Yao, J. (2022). scBERT as a large-scale pretrained deep language model for cell type annotation of single-cell RNA-seq data. Nature Machine Intelligence, 4(10), 852–866. https://doi.org/10.1038/s42256-022-00534-z
40. Biancalani, T., Scalia, G., Buffoni, L., Avasthi, R., Lu, Z., Sanger, A., Tokcan, N., Vanderburg, C. R., Segerstolpe, Å., Zhang, M., Avraham-Davidi, I., Vickovic, S., Nitzan, M., Ma, S., Subramanian, A., Lipinski, M., Buenrostro, J., Brown, N. B., Fanelli, D., … Regev, A. (2021). Deep learning and alignment of spatially resolved single-cell transcriptomes with Tangram. Nature Methods, 18(11), 1352–1362. https://doi.org/10.1038/s41592-021-01264-7
41. Wu, S. Z., Al-Eryani, G., Roden, D. L., Junankar, S., Harvey, K., Andersson, A., Thennavan, A., Wang, C., Torpy, J. R., Bartonicek, N., Wang, T., Larsson, L., Kaczorowski, D., Weisenfeld, N. I., Uytingco, C. R., Chew, J. G., Bent, Z. W., Chan, C.-L., Gnanasambandapillai, V., … Swarbrick, A. (2021). A single-cell and spatially resolved atlas of human breast cancers. Nature Genetics, 53(9), 1334–1347. https://doi.org/10.1038/s41588-021-00911-1
42. Moffitt, J. R., Bambah-Mukku, D., Eichhorn, S. W., Vaughn, E., Shekhar, K., Perez, J. D., Hao, N., Zeng, H., & Zhuang, X. (2018). Molecular, spatial, and functional single-cell profiling of the hypothalamic preoptic region. Science, 362(6416), eaau5324. https://doi.org/10.1126/science.aau5324
43. Chen, W.-T., Lu, A., Craessaerts, K., Pavie, B., Sala Frigerio, C., Corthout, N., Qian, X., Laláková, J., Kühnemund, M., Voytyuk, I., Wolfs, L., Mancuso, R., Salta, E., Balusu, S., Snellinx, A., Munck, S., Jurek, A., Fernandez Navarro, J., Saido, T. C., … De Strooper, B. (2020). Spatial transcriptomics and in situ sequencing to study Alzheimer’s disease. Cell, 182(4), 976–991.e19. https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.07.034
44. Zhang, D., Deng, Y., Kukanja, P., Agirre, E., Bartosovic, M., Dong, M., Ma, C., Ma, S., Su, G., Bao, S., Liu, Y., Xiao, Y., Rosoklija, G. B., Dwork, A. J., Mann, J. J., Leong, K. W., Boldrini, M., Wang, L., Haeussler, M., … Fan, R. (2023). Spatial epigenome–transcriptome co-profiling of mammalian tissues. Nature, 616(7955), 113–122. https://doi.org/10.1038/s41586-023-05795-1
45. Vandereyken, K., Sifrim, A., Thienpont, B., & Voet, T. (2023). Methods and applications for single-cell and spatial multi-omics. Nature Reviews Genetics, 24(8), 494–515. https://doi.org/10.1038/s41576-023-00580-2 
46. 10x Genomics. (2021). Visium spatial gene expression for FFPE: RNA-templated ligation probe design (Technical Note CG000437, Rev. A). https://www.10xgenomics.com/support/spatial-gene-expression-ffpe/documentation/steps/library-construction/visium-spatial-gene-expression-for-ffpe-rna-templated-ligation-probe-design 
47. Cang, Z., Zhao, Y., Almet, A. A., Stabell, A., Ramos, R., Plikus, M. V., Atwood, S. X., & Nie, Q. (2023). Screening cell–cell communication in spatial transcriptomics via collective optimal transport. Nature Methods, 20(2), 218–228. https://doi.org/10.1038/s41592-022-01728-4 
48. 10x Genomics. (2024). Visium spatial gene expression reagent kits user guide (Document No. CG000239, Rev. H). https://www.10xgenomics.com/support/spatial-gene-expression-fresh-frozen/documentation/steps/library-construction/visium-spatial-gene-expression-reagent-kits-user-guide
    

Bioinforange