CRISPR-Cas sistemleri, diziye özgü DNA ve RNA hedeflemesi sağlayarak genetik düzenlemelerde önemli ilerlemelere öncülük etmektedir. Protein tasarımı, doğada gözlenmeyen özgün dizilere ve yapılara sahip RNA rehberli nükleazlar (RNA kılavuzluğunda DNA veya RNA kesen enzimler) yaratarak bu yetenekleri genişletme potansiyeline sahiptir. Ancak bu nükleazlar, etkinlikleri koordineli RNA ve DNA tanıma, aktivasyon ve farklı konformasyonel durumlar (proteinlerin yapısal şekil değişimleri) yoluyla gerçekleşen çok alanlı nükleik asit bağlayıcı karmaşık enzimler olduklarından, bu alandaki tasarım çalışmaları önemli teknik zorluklar barındırmaktadır. Evrimsel verilerle eğitilmiş sekans tabanlı biyolojik dil modelleri, işlevsel nükleazlar üretebilmesine karşın, elde edilen aktif enzimler kapsamlı filtrelemeler sonrasında bile genellikle eğitim aldıkları referans dizilere çok benzer kalmaktadır. Yapı tabanlı rasyonel tasarım yaklaşımları ise doğada bulunmayan yapıları ve yüksek oranda ayrışmış protein dizilerini örnekleme olanağı sunmaktadır; ancak çok alanlı karmaşık enzimlerin tasarımı henüz çözülememiş bir alan olarak kalmaktadır.
Mevcut araştırmalar, sekans tabanlı dil modellerinin doğal dizilere aşırı yakın proteinler üretmesi ve rasyonel tasarımın karmaşık konformasyonel mekanizmaları programlamaktaki sınırlılıklarına yanıt aramayı amaçlamıştır. Araştırmacılar, yapı koşullu bir yaklaşım olan ters protein katlanma modellerinin evrimsel bilgiyle birleştirilmesinin, işlev korunurken yüksek düzeyde çeşitli proteinlerin üretilmesini sağlayıp sağlayamayacağını test etmeyi hedeflemiştir. Bu doğrultuda, CRISPR-Cas12 nükleazlarıyla evrimsel ilişkisi bulunan ve RNA rehberli DNA kesimi gerçekleştiren küçük bir transposon kodlu nükleaz ailesi olan TnpB, doğal evrim tarafından üretilmemiş RNA rehberli nükleazları tasarlamak için bir iskele olarak seçilmiştir. Çalışmanın temel amacı, yapı rehberli ters katlanma modelini evrimsel kalıntı kısıtlamalarıyla eşleştirerek aktif ve doğal olmayan TnpB varyantları tasarlamak ve bunların hücresel ortamlardaki genom düzenleme performansını değerlendirmektir.
Bu hedefe ulaşmak için araştırmacılar, ISDra2 TnpB minimal RNA rehberli nükleazını yeniden tasarlamak amacıyla ESM Inverse Folding (ESM-IF1) yapay zekâ ters katlanma modelini kullanmıştır. Modelin ürettiği dizilerin işlevsel protein-RNA ve protein-DNA temaslarını korumasını sağlamak amacıyla, çoklu sekans hizalamalarından elde edilen konumsal korunum CiC_i değerleri ve genomik veri tabanlarından taranan eşleşmiş TnpB-RNA veya TnpB-DNA dizilerinden elde edilen evrimsel eşleşme sinyalleri σi\sigma_i kullanılarak hedeflenmiş bir maskeleme stratejisi geliştirilmiştir. Belirlenen eşik değerlerini aşan kalıntılar ISDra2 TnpB’deki yabani tip (WT) kimliklerine sabitlenmiş ve bu sayede yapısal ile evrimsel girdiler arasındaki denge ayarlanmıştır. Oluşturulan yapay zekâ tasarımlı SynTnpB varyantları; öncelikle bir bakteri tabanlı seçim sistemiyle taranmış, ardından DNA tanıma ve heterodupleks konumlandırılmasında görev alan REC lobu ile RNA bağlama ve katalitik işlevlerde görev alan NUC lobu ayrı ayrı test edilerek birleştirilmiş ve nihayetinde insan hücrelerinde (HEK293T) mavi floresan protein (BFP) gen nakavtı ile bitki hücrelerinde (Arabidopsis protoplastlarında) hedef gen bölgelerinde test edilmiştir.
Yüksek verimli taramalar sonucunda, yabani tip enzime kıyasla geniş bir dizi çeşitliliği sergileyen ve işlevselliğini koruyan çok sayıda SynTnpB varyantı elde edilmiştir. Toplam 1.980 REC-NUC kombinasyonunun tarandığı bakteri tabanlı seçimde, 466 kombinasyonun saptanabilir aktivite gösterdiği ve tasarımların yaklaşık %8’inin yabani tip TnpB’yi aşan aktivite sergilediği belirlenmiştir. Bakteri tabanlı tarama deneyleri, NUC lobunun yabani tipten sapmalara REC lobuna kıyasla daha yüksek tolerans gösterdiğini ortaya koymuştur. İnsan embriyonik böbrek hücrelerinde (HEK293T) gerçekleştirilen genom düzenleme testlerinde, çoğu varyant yabani tip TnpB ile karşılaştırılabilir düzeylerde aktivite gösterirken özellikle v1 ve v5 varyantları BFP gen nakavtında sırasıyla %46 ve %50 düzenleme verimliliğine ulaşmıştır. Endojen lokuslarda yapılan testlerde de bazı varyantların yabani tip TnpB’ye kıyasla daha yüksek düzenleme verimliliği gösterdiği belirlenmiştir. Örneğin v1 varyantı EMX1 lokusunda yabani tipe kıyasla yaklaşık 3,8 kat daha yüksek düzenleme verimliliği sergilemiştir. Arabidopsis protoplastlarında gerçekleştirilen testlerde de v1 varyantı, değerlendirilen hedeflerin çoğunda yabani tip TnpB’den daha yüksek düzenleme aktivitesi göstermiştir. Bununla birlikte, düzenleme aktivitesindeki artış her varyant için aynı özgüllük profiliyle birlikte gerçekleşmemiştir; bazı SynTnpB varyantlarında ek hedef bölgelerinde aktivite gözlenmiştir. Kriyojenik elektron mikroskobu (cryo-EM) kullanılarak belirlenen 2,8 Å çözünürlüğündeki üç boyutlu yapılar, en fazla ayrışmış aktif varyant olan v7’de tasarlanan kalıntıların farklı konformasyonel durumlarda RNA-DNA arayüzünde yeni stabilize edici temaslar oluşturduğunu ortaya koymuştur. v7’nin aminoasit dizisi yabani tip ISDra2 TnpB ile yaklaşık %77 sekans kimliği paylaşmasına rağmen işlevsel aktivitesini korumuştur. Ayrıca analizler, TAM’a bağlı ve doğal TnpB’de daha önce gözlenmemiş bir ara konformasyonel durumun varlığını ortaya koymuştur.
Elde edilen bu bulgular, yapı ve evrim rehberli ters katlanma modellerinin, doğal dizilerin ötesine geçen işlevsel ve konformasyonel olarak aktif nükleazların oluşturulmasında bir strateji sunabileceğini ortaya koymaktadır. Geliştirilen maskeleme stratejisi ve modüler tasarım yaklaşımı; protein-nükleik asit etkileşimlerinin tasarlanması, çok alanlı biyomoleküllerin tasarlanması ve yapay zekâ destekli protein tasarımı çalışmalarının kapsamının genişletilmesi açısından bir temel sunmaktadır. Araştırma, evrimsel kısıtlamalarla harmanlanmış yapay zekâ modellerinin programlanabilir genom düzenleme yeteneklerini genişletme ve tasarlanabilir protein uzayını büyütme potansiyeline işaret etmektedir.
Yazar: Elinsu Ak
Editör: Özsu Deniz BALKAYA
Referans: Skopintsev, P., Esain-Garcia, I., DeTurk, E. C., Yoon, P. H., Zhou, Z., Weiss, T., Kamalu, M., Chamraj, A., Loi, K. J., Langeberg, C. J., Boger, R. S., Nisonoff, H., Karp, H. M., Chen, L.-X., Shi, H., Vohra, K., Banfield, J. F., Cate, J. H. D., Jacobsen, S. E., & Doudna, J. A. (2026). Structure and evolution-guided design of minimal RNA-guided nucleases. Science, 393(6808), 313–318. https://doi.org/10.1126/science.aed6123
-Bioinforange Bilimsel Haber Servisi-
Haber Yazıları, 20> Etki Faktörlü Q1 dergilerinde yayınlanan (listesi için tıklayınız)
bilimsel araştırmaların ekip arkadaşlarımız tarafından incelenip derlenmesi ile hazırlanmaktadır.
