- Giriş ve Tarihsel Arka Plan
2003 yılında tamamlanan İnsan Genom Projesi ile insan genomuna ait ilk dizinin elde edilmesi, modern biyolojik araştırmaları farklı bir boyuta taşımış; tıp ve biyoteknoloji alanında hızlı ve sonuç odaklı değişimlere neden olmuştur. Bu tarihsel süreçte kullanılan Maxam-Gilbert ve Sanger (birinci nesil dizileme – FGS) nükleik asit dizileme yöntemleri, gelişen bilgisayar teknolojileriyle birleşerek daha ayrıntılı analiz imkânı sağlayan Yeni Nesil Dizileme (NGS) platformlarının geliştirilmesine öncülük etmiştir. NGS; paralel ve yüksek verimli dizileme teknolojilerini tanımlamak için kullanılan kapsayıcı bir ifadedir.
NGS platformları; hız ve maliyet açısından Sanger dizilemeye kıyasla belirgin bir avantaj sağlasa da beraberinde oldukça karmaşık bir veri analizi sürecini getirmektedir. Dideoksinükleotid veya zincir sonlandırma ilkesine dayanan Sanger dizileme yöntemi, yüksek zaman ve maliyet gereksinimine rağmen küçük ölçekli dizileme çalışmaları için halen altın standart olarak kabul edilmektedir. Bu nedenle Sanger dizileme teknikleri, NGS analizlerinden elde edilen sonuçların doğrulanması (konfirmasyonu) amacıyla günümüzde yaygın olarak kullanılmaya devam etmektedir.
- NGS Platformları: SGS ve TGS Karşılaştırması
Dizileme maliyetini ve süresini azaltmak, aynı zamanda dizilemenin doğruluğunu artırmak amacıyla Sanger yöntemi, ikinci nesil dizileme (SGS) veya yüksek verimli dizileme teknolojileri ile değiştirilmiştir. SGS sistemlerinin ana adımları; örnek hazırlama, DNA fragmantasyonu, kitaplık (library) hazırlama, dizileme ve veri analizi süreçlerinden oluşur. Tarihsel süreçte Roche/454 (2005), Illumina/Solexa (2006), ABI/SOLiD (2007) ve Ion Torrent (2010) platformları geliştirilmiş; bunlar arasından Illumina ve Ion Torrent biyomedikal laboratuvarlarda en yaygın kullanılan yöntemler haline gelmiştir.
SGS platformlarının teknik kapasiteleri ve sınırlamaları şu şekildedir:
- Illumina: Hem tek-uçlu (single-end) hem de eşli-uçlu (paired-end) okumalar üretebilmektedir. En büyük sınırlaması, genomun tekrarlayan bölgelerinde hataya neden olan kısa okumalar (short-reads) yapmasıdır.
- Ion Torrent: Yalnızca tek-uçlu (single-end) okumalar üretebilmektedir. Sistemin temel kısıtlaması ise uzun homopolimerik tekrarları yanlış ölçebilmesidir.
SGS teknolojilerinin dezavantajları, düşük dizileme maliyetiyle birkaç kilo bazdan daha uzun okumalar üretebilen üçüncü nesil dizileme (TGS) veya uzun okuma sıralaması yöntemlerinin geliştirilmesini sağlamıştır. Tek moleküllü dizileme (SMS) ve gerçek zamanlı dizileme, TGS teknolojilerinin iki temel özelliği olarak tasarlanmıştır. Günümüzde en yaygın kullanılan TGS platformları; Pacific Biosciences (PacBio) tarafından geliştirilen Tek Molekül Gerçek Zamanlı (SMRT) dizileme ile Oxford Nanopore (ONT) tarafından geliştirilen Nanopore dizilemedir.
- Biyoenformatik Pipelinelar ve Yazılım Mimarisi
NGS platformlarından elde edilen verilerin miktarı arttıkça, bu verilerin işlenmesi ve akışının kontrol edilmesi kritik bir önem kazanmıştır. Bu doğrultuda dizileme verileri, pipeline (boru hattı) adı verilen belirli bir iş akışı çerçevesinde ele alınmaktadır. İş akışlarının ve modüllerin tasarlanmasında işletim sistemi ve yazılım mimarisinin seçimi büyük rol oynar:
- İşletim Sistemi: Açık kaynak kodlu yapısı ve üzerinde işlem yapmaya elverişli olması nedeniyle biyoenformatik analizlerde ağırlıklı olarak Linux işletim sistemi tercih edilmektedir.
- Programlama Dilleri: Veri işlemede nesne yönelimli, geliştirilmesi basit ve veri kütüphaneleri ile uyumlu çalışan Python ve R dilleri öne çıkmaktadır.
- Derin Öğrenme Entegrasyonu: Python programlama dili, PyTorch gibi kütüphaneleri desteklemesi ve yapay zeka/derin öğrenme algoritmalarının kolayca oluşturulabilmesi sayesinde temel düzeyde programlama bilen araştırmacılara büyük avantaj sağlamaktadır. Diğer programlama yöntemleri ise kullanım ve veri kütüphaneleri ile uyumundaki zorluklar nedeniyle günümüzde tercih edilmemektedir.
Standart bir NGS iş akışında yaygın olarak tercih edilen temel biyoenformatik araçlar şunlardır:
- FastQC: Ham NGS verilerini birden fazla kontrol işlemine tabi tutarak her bir baz okuması için detaylı kalite raporu oluşturan bir hata ayıklama ve inceleme modülüdür.
- Hisat2: Dizilemesi yapılan DNA/RNA örneğini tek bir referans genoma hızlı bir şekilde eşleyen (hizalayan) ve FASTQ formatındaki verileri yüksek hız ve paralellikle işleyebilen gelişmiş bir hizalama modülüdür.
- Cutadapt: Okumalardaki adaptör sekanslarını, primerleri ve diğer istenmeyen sekans türlerini tespit edip uzaklaştıran, Python ile rahatça kullanılabilen bir araçtır.
- Genel NGS Biyoenformatik İş Akışı
Uçtan uca standart bir NGS biyoenformatik pipeline süreci aşağıdaki sıralı adımlardan oluşmaktadır:
- Baz Arama (Base Calling) ve FASTQ Dönüşümü: Dizileme cihazından elde edilen ham çoklanmış veriler işlenerek bireysel örneklere ait FASTQ dosyaları elde edilir.
- Kalite İstatistiği ve Adaptör Kırpma: FASTQ verileri FASTQ-QC ile kalite denetimine tabi tutulur; eşzamanlı olarak adaptör kırpma işlemleri yapılarak analize hazır FASTQ dosyaları oluşturulur.
- Referans Genom Hizalaması: Okumalar referans genom ile hizalanarak ikili hizalama haritası olan BAM (binary alignment map) formatına dönüştürülür.
- BAM İşleme ve BAM-QC: Hizalanmış veriler ön varyant incelemesinden geçirilir, işlenmiş BAM dosyası elde edilir ve BAM-QC adımıyla sonuçların istatistikleri çıkarılır.
- Varyant Çağırma (Variant Calling): Tam varyant inceleme modülleri aracılığıyla SNV (tek nükleotid varyasyonu), Indel (insersiyon-delesyon) ve karmaşık Indel sonuçları tespit edilerek varyant çağrı formatındaki VCF (variant call format) dosyası üretilir.
- Filtreleme, HGVS Notasyonu ve Tıbbi Raporlama: VCF verileri olumlu-olumsuz kriterlerine göre filtrelenir; HGVS (İnsan Genom Varyasyon Topluluğu) standartlarına uygun notasyon verilir, detaylı varyant yorumlaması yapılarak nihai tıbbi rapor çıktısı hazırlanır.
- İş Akışı Yönetim Sistemleri (WMS) ve DolphinNext
NGS verilerinin hacmi ve karmaşıklığı; hesaplamalı analizlerde ölçeklenebilirlik ve tekrarlanabilirlik ilkelerini zorunlu hale getirmiştir. Bu zorluklara yanıt olarak geliştirilen İş Akışı Yönetim Sistemleri (WMS – Workflow Management Systems); bulunabilir, erişilebilir, birlikte çalışabilir ve yeniden üretilebilir FAIR protokollerini esas alır. WMS mimarileri, kapsayıcı (container) yazılımların (ör. Docker) ve standart uygulama programlama arayüzlerinin (API) kullanımını destekler. Nextflow yaygın kullanılan bir WMS örneğidir; ancak yapılacak işlemin boyutu ve karmaşıklığı arttıkça bazı sınırlamalara sahiptir.
Programlama bilgisi olmayan araştırmacılar için Grafik Kullanıcı Arayüzü (GUI) büyük bir kolaylık sağlar. Ancak Galaxy, GenePattern veya GeneProf gibi geleneksel GUI tabanlı platformlar veri işleme ortamları arasında paralellik ve taşınabilirlik sağlayamamaktadır.
Bu sorunları gidermek amacıyla geliştirilen Biocore: DolphinNext platformu şu teknik avantajları sunmaktadır:
- Sürükle-Bırak Arayüzü: DolphinNext, kullanıcıların programlama dillerini detaylı bilmesine gerek kalmadan sürükle-bırak yöntemiyle modülleri birleştirip istediği iş akış modelini oluşturmasına olanak tanır.
- Docker ve Bulut Entegrasyonu: Çalışmaların Docker veri sanallaştırma araçları ve bulut sistemleri üzerinden yürütülebilmesi, analizlerin hızlı ve kolayca tekrarlanabilmesini sağlar; teknik desteği sınırlı olan projelere düşük kaynakla en iyi sonucu alma imkanı sunar.
- Modüler RNA-Seq Pipeline Mimarisi: Platform üzerinde tasarlanan bir RNA dizileme (RNA-Seq) iş akışında; referans genom verisi Build_Index modülünde işlenerek indeks çıktısı üretilir. Mate (örnek miRNA listesi) ve reads (dizileme okumaları) girdileri Fastq modülüyle işlenir; STAR modülü bu girdileri düzenleyerek referans genoma hizalar ve ikili sıkıştırılmış BAM çıktısını verir. Elde edilen BAM verisi BAM_Analysis_Module üzerinden geçirilerek Picard, RseQC, BigWig ve IGV gibi çıktı modülleriyle işlenir ve eksiksiz bir RNA-Seq analiz çıktısına dönüştürülür.
- Gelecek Perspektifi: Disiplinlerarası Biyoenformatik Devrimi
Genom çağı, NGS platformları sayesinde insan dahil pek çok organizma hakkında genetik bilginin en ince ayrıntılarına erişim imkânı sunmuştur. Bu devasa veri havuzunun işlenmesi; programlama dilleri, hesaplamalı analizler ve biyolojik araştırmalar arasında biyoenformatik iş birliğini zorunlu kılmaktadır.
Geliştirilen biyoenformatik pipelineların gelecekteki en önemli yönü; genetik bilgiye ulaşan biyoloji temelli bilim insanları ile bu bilgiyi analiz eden biyoenformatik uzmanlarının bütünleyici bir yaklaşımla değerlendirilmesidir. DolphinNext gibi platformlar, hesaplamalı analizleri deneysel araştırmacılar için tekrarlanabilir, erişilebilir ve yorumlanabilir hale getirmektedir. Benzeri sezgisel araçların yaygınlaşması, veri analizlerindeki hata oranını azaltacağı gibi özellikle klinik araştırmalarda ve hastalık mekanizmalarının aydınlatılmasında yeni imkanlar sağlayacaktır.
Derleyen: Hazel BİRGÜL
