1.Giriş
Moleküler biyolojinin ve tıbbın en büyük hedeflerinden biri, genetik hastalıkların kaynağı olan mutasyonları genom seviyesinde kalıcı ve güvenli bir şekilde düzeltebilmektir. Genom düzenleme yaklaşımları, yaşamı tehdit eden durumların (örneğin, kalıtsal bozukluklar) tedavisinden gen ekspresyon çalışmalarında kaybedilen fonksiyonun geri kazanılmasına kadar çeşitli hastalık türlerinde kullanılmıştır. Genom düzenleme prosedürü esas olarak hedef dizinin bulunduğu yerde nükleazlar tarafından çift zincirli kırılmalar (DSB’ler) oluşturmaya dayanır. Bu prosedürü kullanan CRISPR-Cas9 teknolojisinin keşfi, genom mühendisliğinde yeni bir çağ başlatmıştır. Ancak, geleneksel CRISPR-Cas9 sisteminin hedef bölgede çift zincir kırığı (DSB – Double Strand Break) oluşturarak çalışması hücre içindeki dinamiklerde genomik bütünlük açısından ciddi bir tehdit unsuru olup; p53 aktivasyonu yoluyla apoptozu tetikleyebilir veya kontrolsüz kromozomal translokasyonlara, büyük delesyonlara ve genomik instabiliteye yol açabilir1.
Cas9 (CRISPR-associated system) tarafından indüklenen bu çift zincir kırıkları, hücrenin kendi doğal DNA tamir mekanizmaları tarafından onarılmak zorundadır. Hücre, bu kırıkları onarmak için çoğunlukla hata eğilimli olan Homolog Olmayan Uç Birleştirme (NHEJ – Non-Homologous End Joining) yolunu seçer. NHEJ, kırık uçları rastgele birleştirirken hedef bölgede kontrolsüz insersiyon ve delesyon mutasyonlarına neden olur. Bu durum gen nakavtı (knock-out) için ideal olsa da hassas gen onarımı için elverişsizdir. Öte yandan, mutasyonun hatasız düzeltilmesi için ihtiyaç duyulan Homolog Yönlendirmeli Tamir (HDR – Homology-Directed Repair) mekanizması, sadece hücre döngüsünün S ve G2 evrelerinde aktiftir ve nöronlar, kas hücreleri vb. bölünmeyen somatik hücrelerde verimliliği son derece düşüktür. Dolayısıyla, geleneksel CRISPR mekanizmalarıyla yüksek doğrulukta bir genetik onarım gerçekleştirmek teorik ve pratik kısıtlamalara takılmaktadır.2 Bu kısıtlamaları aşmak ve hassas tıp (precision medicine) standartlarına ulaşmak amacıyla, genom mühendisliği çift zincir kırığı yaratmayan yeni nesil teknolojilere evrilmiştir. Bu evrimin en kritik basamaklarını, DNA zincirlerini tamamen koparmadan tek baz değişimlerine olanak tanıyan Baz Düzenleyiciler (Base Editors) ve genoma bir kelime işlemci gibi yaklaşarak “arama ve yazma” felsefesiyle çalışan prime düzenleyiciler (prime editors) oluşturmaktadır. Bu araçlar, Cas9 nükleaz aktivitesini körelterek sadece tek bir zinciri çentikleyen akıllı enzim kompleksleri kullanır2.
2. Doğanın Mühendisliği: CRISPR
Bakteriler ve Arkeler, bakteriyofajlar (faj) ve diğer genetik elementlerden kaynaklanan enfeksiyon gibi streslere sıklıkla maruz kalırlar. Bakteriler, genetik akışı düzenlemek ve faj enfeksiyonuna direnmek için birden fazla yönteme sahiptir. Bu mekanizmalar arasında hücre yüzey reseptörlerinin mutasyonu veya maskelenmesi, kısıtlama-modifikasyon, başarısız enfeksiyon ve kümelenmiş düzenli aralıklı kısa palindromik tekrarlar (CRISPR) sistemleri yer almaktadır3. Dolayısıyla CRISPR teknolojisi, laboratuvarda sıfırdan geliştirilen bir mekanizma olmayıp, özünde prokaryotik organizmaların virüslere karşı geliştirdiği adaptif bir savunma sistemine dayanmaktadır. Doğadaki bu orijinal savunma mekanizması, Şekil 1’de gösterilen birbirini takip eden üç temel aşamadan oluşur:
Bakteri, Cas proteinleri aracılığıyla virüs DNA’sından küçük bir parça keser. Ardından bu yabancı DNA parçası, adaptasyon evresinde görev alan Cas1–Cas2 kompleksi tarafından bakterinin kendi genomundaki CRISPR lokusuna entegre edilir3.
Aynı veya benzer bir virüs bakteriye tekrar saldırdığında, bakteri CRISPR lokusundaki bu hafıza kayıtlarını hızla transkribe ederek uzun bir pre-crRNA zinciri üretir. Daha sonra bu zincir, tracrRNA4 adı verilen yapısal bir RNA ve RNAse III enzimi yardımıyla işlenerek küçük parçalara bölünür. Sonuçta, her biri tek bir virüs dizisine spesifik olan crRNA (CRISPR RNA) molekülleri olgunlaşır.
Olgunlaşan crRNA ve yapısal destek sağlayan tracrRNA molekülleri, Cas9 endonükleaz enzimi ile birleşerek aktif bir ribonükleoprotein (RNP) kompleksi oluşturur4.
RNP kompleksi, hücre içinde gezerek virüsün enjekte ettiği DNA’yı tarar. Eğer virüs DNA’sındaki sekans, crRNA’daki rehber dizilim ile birebir eşleşirse (ve hemen yanında PAM adı verilen kısa bir protospacer komşu motif bulunuyorsa), Cas9 enzimi hedef bölgede çift zincirli DNA kırığı (DSB) oluşturarak virüs genomunu parçalar. DNA’sı parçalanan virüs replike olamaz ve enfeksiyon önlenir5.
2.1 Hücre İçi DNA Tamir Mekanizmaları
Laboratuvarda bir genom düzenleme aracına dönüştürülen CRISPR-Cas9 mekanizmasındaki bu girişim aşaması doğal adaptasyondakine benzer şekilde sentetik kılavuz RNA’nın (sgRNA’nın) yönlendirmesiyle Cas9 nükleazının hedef bölgede DSB oluşturmasına sebep olur. Cas9 tarafından indüklenen bu kırık, hücre için ölümcül bir tehdit oluşturduğundan, konak hücrenin endojen DNA tamir mekanizmaları derhal devreye girer. Bu aşamada hücre, kırığın onarımı için temelde iki farklı moleküler yolak seçer (Şekil 2):
2.1.1 Homolog Olmayan Uç Birleştirme (NHEJ – Non-Homologous End Joining)
Bunlardan ilki ve hücre döngüsünün her evresinde hiç vakit kaybetmeden devreye giren baskın mekanizma, Homolog Olmayan Uç Birleştirme (NHEJ) yolağıdır. NHEJ, elinde herhangi bir kalıp ya da rehber DNA dizisi olmadan, kopan iki ucu adeta körlemesine ve alelacele birbirine yapıştırmaya çalışır. Tabiatı gereği oldukça hata eğilimli (error-prone) olan bu süreç, kesim noktasında kontrolsüz nükleotit kazanımlarına veya kayıplarına, sebep olan indel mutasyonlarına yol açar. Genom mühendisliğinde bu indeller, hedef genin okuma çerçevesini (reading frame) kaydırıp proteini işlevsizleştirerek gen susturma (knock-out) çalışmaları için harika birer avantaja dönüşebilir. Fakat iş, genetik bir kusuru nükleotit düzeyinde yüksek doğrulukta onarmaya ve tedavi etmeye geldiğinde, NHEJ’in bu kontrolsüz doğası sistemin önündeki en büyük biyogüvenlik engeli haline gelmektedir7.
2.1.2 Homolog Yönlendirmeli Onarım (HDR – Homology-Directed Repair)
Eğer hücreye Cas9 ve kılavuz RNA ile birlikte, düzeltilmek istenen diziyi taşıyan harici bir donör DNA da eş zamanlı olarak verilirse, hücre yüksek doğruluklu çalışan HDR yolağını tetikleyebilir. HDR, donör DNA’yı kalıp alarak kesim bölgesini nükleotit düzeyinde kusursuz bir şekilde tamir eder ve teorik olarak “hatasız gen onarımı” sağlar. Ancak HDR’ın klinik uygulamalardaki başarısı oldukça sınırlıdır; çünkü bu yolak sadece bölünmekte olan hücrelerin S ve G2 fazlarında aktiftir, bölünmeyen somatik hücrelerde (nöronlar, kas hücreleri vb.) neredeyse hiç çalışmaz ve hücre içi verimliliği NHEJ ile rekabet edemeyecek kadar düşüktür7.
2.2 Cas 9 Nükleazın Hedef Dışı Etkisi
Hedef dışı genom düzenlemesi, tasarlanmış bir nükleaz kullanıldığında ortaya çıkan, istenmeyen ve spesifik olmayan bir genetik modifikasyon türüdür. Bu genetik modifikasyonun sıklığı, doğası ve konumu açıkça belirtilmemiş olsa bile, sgRNA kılavuz dizisinin PAM-uzak kısmında üç ila beş baz çifti uyumsuzluğu olan DNA dizilerinde bile potansiyel hedef dışı kesim aktivitesi meydana gelebilir7. Hedef dışı bu modifikasyonlar; genom bütünlüğünün bozulması, onkojenik yolakların tetiklenmesi, kritik tümör baskılayıcı genlerin inaktivasyonu ve hücresel düzeyde öngörülemeyen bağışıklık yanıtlarının indüklenmesi gibi ölümcül moleküler sonuçlar doğurabilir5.
2.3 DNA Çentikleme (Nicking/Cas9n) Stratejisi: Çift Zinciri Kesmeden Düzenleme
Geleneksel Cas9 nükleazının hedef bölgede ve hedef dışı (off-target) lokuslarda yarattığı çift zincir kırıkları (DSB), hücreyi NHEJ ve HDR gibi riskli ya da verimsiz tamir yollarına mecbur bırakmaktadır. Genom mühendisliğinde daha hassas ve güvenli genetik düzenleme stratejileri geliştirebilmek amacıyla, çift zincirli DNA kırıkları oluşturan geleneksel Cas9 yaklaşımının sınırlamalarını aşan yeni teknolojilere ihtiyaç duyulmuştur. Bu noktada atılan en önemli evrimsel adım, yabani tip Cas9 proteininin moleküler mimarisini değiştirerek nickase Cas9 (nCas9) varyantını geliştirmek olmuştur7.
nCas9, nükleaz aktivitesinden sorumlu olan iki ana kesici bölgeden (RuvC ve HNH domainleri) birinin (genellikle D10A mutasyonu ile) işlevsiz hale getirilmesiyle elde edilir. Bu modifikasyon sayesinde enzim, çift zincirli DNA’da kırık oluşturmak yerine yalnızca tek DNA zincirinde kontrollü bir çentik (nick) oluşturur.
Hücre mekanizması için tek zincirli bu çentikler, çift zincir kırıkları gibi ölümcül birer kriz anlamı taşımaz. Hücre, bu tek zincirli hasarları hata eğilimli NHEJ yolağını hiç devreye sokmadan, yüksek doğrulukla çalışan baz kesim tamiri (BER) veya nükleotid kesim tamiri gibi mekanizmalarla indelsiz bir şekilde kapatır8.
İşte bu çentikleme stratejisi, genom mühendisliğinde yeni bir yaklaşımın önünü açmıştır. Nitekim nCas9, tek başına büyük bir genetik değişiklik gerçekleştirmese de, DNA’yı kesmeden manipüle etmeyi sağlayan Baz Düzenleme (Base Editing) ve Prime Düzenleme (Prime Editing) teknolojilerinin geliştirilmesine temel oluşturmuştur.
3. Baz Düzenleme (Base Editing) Teknolojisi
Baz düzenleyiciler, katalitik olarak aktif olmayan veya yalnızca tek DNA zincirini kesebilen nCas9’un tek zincirli DNA’ya özgü deaminaz enzimleriyle kaynaştırılmasıyla elde edilir. Sonuçta bir füzyon proteini oluşur. Cas9-deaminaz füzyon protein kompleksi, bir kılavuz RNA (gRNA) tarafından belirli bir DNA lokusuna yönlendirilir . Baz düzenleyici hedef dizisine bağlandıktan sonra, deaminaz hedef bölgenin R-halkasının açıkta kalan hedef olmayan ipliği (NTS) içindeki bazları değiştirebilir. Bazların değiştirilebildiği hedef lokus alanı, baz düzenleme penceresi olarak adlandırılır (Şekil 3’e bakınız). Hedeflenen spesifik modifikasyona bağlı olarak, baz düzenleyici kompleksine verimliliği artırmak veya baz değişiminin sonucunu değiştirmek için başka faktörler de dahil edilebilir9.
Bu kimyasal manipülasyon temelde iki ana editör sınıfı üzerinden yürütülür:
3.1 Sitozin Baz Editörleri (CBE’ler)
Birinci nesil baz düzenleyici (CBE1), Liu ve çalışma arkadaşları tarafından 2016 yılında geliştirilmiştir. CBE1’ler sıçan tarafından türetilen sitidin deaminaz enzimi sayesinde hedef bölgedeki sitozin (C), urasile (U) dönüştürür. Hücre, RNA’ya özgü olan urasil bazının DNA’da bulunmasını bir hasar olarak algılar. Hücrenin kendi baz kesim tamiri (BER) mekanizması sırasında Urasil N-glikozilaz (UNG) enzimi araclığyla bu uyumsuzluğu tanır ve urasil ile DNA’nın deoksiriboz omurgası arasındaki glikozidik bağı keserek bu yapıyı uzaklaştırır. Böylece sistem, hedeflenen bir CG baz çiftini hatasız bir şekilde TA çiftine dönüştürmüş olur. Ancak CBE1 in vitro’da verimli, hedefli baz düzenlemeyi sağlasa da (%1,1 indel oluşum oranıyla %37’ye kadar düzenleme), insan hücrelerinde etkili değildir. Bu durum, birinci nesil CBE1 sistemlerinin yerine daha yüksek düzenleme verimliliği sunan baz tamir mekanizmaları geliştirmeye yönlendirmiştir. Baz düzenleme verimliliğini artırmak amacıyla, UNG aktivitesini spesifik olarak bloke eden bir Urasil DNA Glikozilaz İnhibitörü (UGI) proteini, CBE1 yapısının C-terminaline moleküler olarak kaynaştırılması sonucu ikinci nesil bir sitozin baz düzenleyici (CBE2) geliştirilmiştir. Yeni oluşan bu ikinci nesil sitozin baz editörü (CBE2), UGI sayesinde hücrenin BER mekanizmasını geçici olarak inhibe eder. Tamir mekanizmasının inhibe edilmesiyle, insan hücrelerindeki genetik düzenleme verimliliğinde üç katlık bir artış elde edilmiştir10.
3.2 Adenin Baz Editörleri (ABE’ler)
CBE’ler sadece CG’den TA’e dönüşümü yapabilmesi, bu teknolojiyle tedavi edilebilecek genetik hastalık havuzunu büyük ölçüde sınırlandırmaktadır. Buna karşın İnsanlardaki patojenik nokta mutasyonlarının neredeyse yarısı, AT çiftinin tekrar GC çiftine dönüştürülmesi için kullanılan ABE ile düzeltilebilir. Bu nedenle, baz düzenleme yetenekleri ve genetik hastalıkların incelenmesi, A’dan G’ye dönüşümleri indükleyebilen yeni bir adenin baz düzenleyici sınıfının geliştirilmesiyle daha da genişletilmiştir10. ABE aracılı düzenleme, mekanizma olarak CBE aracılı DNA düzenlenmesiyle benzer bir mantıkla çalışır. ABE-Cas9 füzyon kompleksi gRNA aracılığıyla hedef bölgeye bağlandığında, yapısındaki deoksiadenozin deaminaz alanı adeninden (A) inozine (I) geçişi katalize eder. DNA replikasyonu bağlamında, hücre içi polimerazlar tarafından guanin (G) olarak yorumlanan inozin ara ürünü sayesinde, orijinal AT baz çifti hedef lokusta kalıcı bir GC çiftiyle yer değiştirir12
Sitozin deaminazların aksine, doğada tek sarmallı DNA (ssDNA) üzerinde aktivite gösteren bir adenozin deaminaz enzimi bulunmamaktadır. Doğadaki mevcut adenozin deaminaz enzimleri sadece RNA substratlarına etki edebilmektedir. Hücre içi uygulamalarda karşılaşılan bu doğal enzim sınırlamasının yarattığı eksiklik, David Lui ve grubunun Escherichia coli kökenli tRNA adenozin deaminazını (ecTadA) protein mühendisliği ve yönlendirilmiş evrim süreçlerine tabi tutulmasıyla aşılmıştır.
Normal koşullarda tRNA’nın tek sarmallı antikodon döngüsünde çalışan ecTadA, bakteriyel sistemlerde antibiyotik direncine dayalı bir seçilim baskısı altında evrimleştirilmiştir. Mutant kloramfenikol direnç genindeki hedef adenini düzeltebilen başarılı deaminaz varyantı (TadA), bir XTEN polipeptit bağlayıcısıyla nCas9’un N-terminaline kaynaştırılmış ve C-terminaline nükleer lokalizasyon sinyali (NLS) eklenerek birinci nesil ABE (ABE1.2) sistemi geliştirilmiştir. Sitozin baz düzenlemesiyle karşılaştırıldığında, ABE yaklaşımı çok daha avantajlı bir biyokimyasal profile sahiptir13.
Baz editörleri üzerindeki protein mühendisliği çalışmaları her geçen gün genişlemektedir. Günümüzde sadece geçiş mutasyonları değil, transizyonları hedefleyen C-G baz editörleri (CGBE), hem A hem C bazını aynı anda değiştirebilen çift (dual) editörler ve mitokondri gibi organelleri hedefleyen özelleşmiş versiyonlar geliştirilmiştir. Hastalığa yol açan mutasyonların nükleotit düzeyinde düzeltilebildiğini kanıtlayan başarılı preklinik çalışmalar, orak hücreli anemi, beta-talasemi ve hiperkolesterolemi gibi genetik hastalıkların tedavisinde yenilikçi taşıyıcı sistemler kullanılarak in vivo klinik denemelerin kapısını aralamıştır12.
Baz düzenleme teknolojisi, çift zincir kırığı (DSB) yaratmadan tek nükleotit seviyesinde modifikasyon yapabilme yeteneği ile büyük bir inovasyon sunsa da, klinik ve laboratuvar uygulamalarında birtakım yapısal kısıtlamalarla karşı karşıyadır. Bu kısıtlamaların ilki ve en yaygını, sistemin hedef pencerelerindeki spesifiklik sorunudur. Baz düzenleyiciler, kanonik olarak 4-5 nükleotit (nt) genişliğindeki dar bir aktivite penceresi içinde deaminasyon gerçekleştirmektedir. Dolayısıyla, hedef sitozin veya adenin nükleotidine komşu olan diğer C veya A bazları da bu esnada deaminasyona uğrayabilmekte ve “yan düzenleme” (bystander editing)12 adı verilen istenmeyen modifikasyonlar tetiklenmektedir.
Genlerin kodlama dizilerinde (open reading frame) değişiklik yaparken, geçiş (transizyon) mutasyonlarının genetik koddaki eş anlamlı (silent/sessiz) doğasından ötürü, bu yan düzenlemeler eş anlamlı mutasyonlarla sonuçlandığı için genellikle fenotipik bir değişime yol açmadan atlatılabilmektedir. Ancak kritik kodonları barındıran lokuslarda, komşu nükleotitlerin bu kontrol dışı dönüşümünden kaçınmak biyolojik olarak oldukça güçtür ve bu durum fonksiyonel protein hasarlarına zemin hazırlayabilmektedir14.
Sistemin ikinci temel yapısal kısıtlılığı, Cas alanının hedefleme menziliyle ilgilidir. Baz düzenleme aktivitesinin kusursuz çalışabilmesi, hedef nükleotitten belirli bir mesafe aralığında spesifik bir Protospacer Bitişik Motif (PAM) dizisinin varlığını zorunlu kılmaktadır. Uygun koordinatta bir PAM dizisinin bulunmaması, hedef mutasyonun sistem tarafından atlanmasına neden olmaktadır. Dahası, erken nesil bazı baz düzenleyicilerin hem DNA ve RNA’da rastgele hedef dışı (off-target) mutasyonları indüklediği bilinmektedir15.
Baz editörleri üzerindeki protein mühendisliği çalışmaları her geçen gün dezavantajların çoğunu hafifletmeyi başarmış olsa da mevcut baz düzenleyiciler doğası gereği 12 olası nokta mutasyon türünden yalnızca altısını gerçekleştirilebilmektedir. Küçük nükleotit eklemeleri (insersiyon), silmeleri (delesyon) ve transpozisyonlar gibi hayati öneme sahip diğer birçok DNA modifikasyon sınıfının baz düzenleme sistemlerinin kapsamı dışında kalmaktadır. Bu sınırlamalar, daha geniş düzenleme kapasitesine sahip yeni nesil genom düzenleme teknolojilerinin geliştirilmesini gerekli kılmış ve bunun sonucunda Prime Editing yaklaşımı ortaya çıkmıştır.16
4. Prime Düzenleme (Prime Editing) Teknolojisi
Hassas ve son derece çok yönlü bir gen düzenleme teknolojisine duyulan ihtiyaçtan yola çıkan prime düzenleme, doğrudan çift sarmal kırılmaları (DSB) oluşturmadan, canlı hücrelerin genomlarındaki hedef bölgelere her türlü DNA ikamesini, küçük eklemeleri ve küçük silmeleri yerleştirmeyi mümkün kılar.17
Prime düzenleme en az 1 prime düzenleyici protein (PE) tarafından gerçekleşir. Bu protein Cas9 nickase (Cas9n-H840A veya D10A) proteininin C-terminaline, bir Ters Transkriptaz (RT – Reverse Transcriptase) enziminin moleküler olarak kaynaştırılmasıyla elde edilir. Düzenleme için sadece bu protein kompleksi yeterli değildir. Klasik sgRNA’dan farklı olarak sistem hedef bölgeyi spesifik olarak tanımlayan ve istenen nükleotit modifikasyonunu üzerinde barındıran programlanabilir bir prime düzenleme kılavuz RNA’sına (pegRNA) ihtiyaç duyar.18
Bir pegRNA molekülü, sgRNA yapısının 3ʹ ucuna eklenmiş iki kritik domain barındırır:
Primer Bağlanma Bölgesi (PBS – Primer Binding Site): Cas9n tarafından çentiklenen tek zincirli hedef DNA’nın, pegRNA’ya baz eşleşmesi kurarak tutunmasını sağlayan sekanstır.
Ters Transkriptaz Kalıbı (RTT – Reverse Transcriptase Template): Düzeltilmek istenen yeni nükleotit dizilimini (veya insersiyon/delesyon bilgisini) şifreleyen ve RT enzimi tarafından DNA’ya ters transkribe olacak RNA kalıbıdır.
4.1. Prime Düzenlemenin Kökeni, Moleküler Mimarisi ve pegRNA Tasarımı
Prime düzenleme teknolojisi, David Liu ve çalışma arkadaşları tarafından genomik DNA’yı doğrudan yeniden yazabilmek amacıyla geliştirilmiştir. Orijinal birinci nesil prime düzenleyici (PE1), Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9) proteinin H840A nükleaz mutantının, Moloney fare lösemi virüsünden (MMLV) elde edilen vahşi tip Ters Transkriptaz (RT) enzimine moleküler düzeyde kaynaştırılmasıyla oluşturulmuştur.
Bu sistemin işlev görebilmesi, PE1 kompleksini genomik hedef bölgeye yönlendiren bir ara dizi (spacer) içeren ve arzu edilen modifikasyonu şifreleyen kritik bir 3ʹ uzantısına sahip, özel olarak tasarlanmış bir kılavuz RNA olan pegRNA kullanımını zorunlu kılar. Hücre içinde prime düzenleyici-pegRNA kompleksi, pegRNA ara dizisine tamamlayıcı olan genomik hedef lokusa bağlanarak lokal bir R-döngüsü yapısı meydana getirir.18
4.2. Search-and-Write (Arama ve Yazma) Mekanizması
Düzenleme döngüsünün başlaması için PE kompleksi, genomik hedef lokusta kontrollü bir çentik açar ve pegRNA’nın 3ʹ ucundaki RNA şablonunu (RTT) kalıp alarak bu kesim noktasından itibaren yeni bir DNA dizisi sentezler. Sentezlenen bu modifiye DNA ipliğinin konak genomuna kalıcı olarak entegre edilmesi süreci; endojen hücresel onarım mekanizmaları tarafından yürütülür ve bu entegrasyon başarısı, düzenlenmemiş karşı zincirin de eş zamanlı olarak çentiklenmesi ile önemli ölçüde desteklenebilir.16
4.3 PE Nesillerinin Evrimi ve Hücresel Faktörler
Prime düzenlemede ilk nesil (PE1) sistemlerin karşılaştığı en büyük verimliliklerinin düşük olmasıdır. Hücrenin doğal uyumsuzluk tamiri (MMR) mekanizmasının yeni sentezlenen düzenlenmiş DNA kanadını hata olarak algılayıp uzaklaştırılmasıdır. Bu engeli aşmak amacıyla geliştirilen PE2 sistemi, modifiye edilmiş MMLV RT enzimiyle reaksiyon kararlılığını artırır. PE3 sistemi, pegRNA’ya ek olarak tasarlanan ikincil bir sgRNA yardımıyla düzenlenmemiş karşı zinciri kontrollü bir şekilde çentikler. Bu ikili çentikleme stratejisi, hücrenin onarım mekanizmasını manipüle ederek karşı zincir sentezlenirken hatasız olan yeni modifiye ipliğin kalıp alınmasını sağlar ve düzenleme verimliliğini artırır.19
5.Sonuç ve Gelecek Perspektifleri
Genom mühendisliği, geleneksel CRISPR-Cas9 sisteminin sunduğu çift zincir kırıkları (DSB) ve buna bağlı gelişen hedef dışı (off-target) etkiler gibi biyolojik kısıtlamaları aşmak adına son derece dinamik bir evrim geçirmektedir. Bu süreçte ortaya çıkan Baz Düzenleme (Base Editing) teknolojisi, DNA yapısını bozmadan yüksek doğrulukla tek baz değişimlerine olanak tanıyarak nokta mutasyonlarının onarımında kritik bir avantaj sağlamıştır. Bu yaklaşımın sınırlılıklarını aşmak amacıyla geliştirilen Prime Düzenleme (Prime Editing) ise DSB yaratmaksızın insersiyon ve delesyon gibi çok yönlü DNA modifikasyonlarını gerçekleştirebilme yeteneğiyle, genomik dizilimlerin doğrudan ve yüksek bir hassasiyetle yeniden programlanmasına olanak tanımıştır.
Mevcut yeni nesil genom düzenleme teknolojileri, hücre içi düzenleme verimliliğinin artırılması, potansiyel hedef dışı etkinliklerin en aza indirilmesi ve in vivo doku/organ düzeyinde güvenli taşıyıcı sistemlerin geliştirilmesi açısından moleküler optimizasyonlara açıktır. Karşılaşılan bu yapısal ve pratik zorluklara rağmen; her geçen gün gelişen yaklaşımlar ve özelleşmiş kılavuz RNA tasarımları, sistemlerin spesifikliği ve güvenirliğini yükseltmektedir. Sonuç olarak, hassas genom düzenleme araçları sundukları yüksek özgüllük ve çok yönlü modifikasyon yeteneği ile geleceğin kişiselleştirilmiş tıp ve gen terapisi uygulamalarında dönüştürücü bir terapötik potansiyel vadetmektedir.
Derleyen: Ayzer YILDIRGAN
Editör: Beray KALELİOĞLU
Referanslar:
1. Testa, L. C., & Musunuru, K. (2023). Base editing and prime editing: Potential therapeutic options for rare and common diseases. BioDrugs, 37(4), 453–462. https://doi.org/10.1007/s40259-023-00610-9
2. Ansori, A. N. M., Antonius, Y., Susilo, R. J. K., Hayaza, S., Kharisma, V. D., Parikesit, A. A., Zainul, R., Jakhmola, V., Saklani, T., Rebezov, M., Ullah, M. E., Maksimiuk, N., Derkho, M., & Burkov, P. (2023). Application of CRISPR-Cas9 genome editing technology in various fields: A review. Narra J, 3(2), e184. https://doi.org/10.52225/narra.v3i2.184
3. Richter, C., Chang, J. T., & Fineran, P. C. (2012). Function and regulation of clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) / CRISPR associated (Cas) systems. Viruses, 4(10), 2291–2311. https://doi.org/10.3390/v4102291
4. Deltcheva, E., Chylinski, K., Sharma, C. M., Gonzales, K., Chao, Y., Pirzada, Z. A., Eckert, M. R., Vogel, J., & Charpentier, E. (2011). CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III. Nature, 471(7340), 602–607. https://doi.org/10.1038/nature09886
5. Asmamaw Mengstie, M., Teshome Azezew, M., Asmamaw Dejenie, T., Teshome, A. A., Tadele Admasu, F., Behaile Teklemariam, A., Tilahun Mulu, A., Mekonnen Agidew, M., Adugna, D. G., Geremew, H., & Abebe, E. C. (2024). Recent advancements in reducing the off-target effect of CRISPR-Cas9 genome editing. Biologics: Targets and Therapy, 18, 21–28. https://doi.org/10.2147/BTT.S429411
6. BioRender. (2021). 2020 Nobel Prize in Chemistry: A Tool for Genome Editing (CRISPR‐Cas9) [Şablon]. 26 Temmuz 2026 tarihinde https://app.biorender.com/biorender-templates adresinden erişildi.
7. Guo, C., Ma, X., Gao, F., & Guo, Y. (2023). Off-target effects in CRISPR/Cas9 gene editing. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology, 11, 1143157. https://doi.org/10.3389/fbioe.2023.1143157
8. Klermund, J., Rhiel, M., Kocher, T., Chmielewski, K. O., Bischof, J., Andrieux, G., el Gaz, M., Hainzl, S., Boerries, M., Cornu, T. I., Koller, U., & Cathomen, T. (2024). On- and off-target effects of paired CRISPR-Cas nickase in primary human cells. Molecular Therapy, 32(5), 1298–1310. https://doi.org/10.1016/j.ymthe.2024.03.006
9. Popovitz, J., Sharma, R., Hoshyar, R., Kim, B. S., Murthy, N., & Lee, K. (2023). Gene editing therapeutics based on mRNA delivery. Advanced Drug Delivery Reviews, 200, Makale 115026.https://doi.org/10.1016/j.addr.2023.115026
10.Fichter, K. M., Setayesh, T., & Malik, P. (2023). Strategies for precise gene edits in mammalian cells. Molecular Therapy – Nucleic Acids, 32, 536–552. https://doi.org/10.1016/j.omtn.2023.04.012
11. Gaudelli, N. M., Komor, A. C., Rees, H. A., Packer, M. S., Badran, A. H., Bryson, D. I., & Liu, D. R. (2017). Programmable base editing of A•T to G•C in genomic DNA without DNA cleavage. Nature, 551(7681), 464–471. https://doi.org/10.1038/nature24644
12. Aliciaslan, M., Erbasan, E., Erendor, F., & Sanlioglu, S. (2024). Advances in CRISPR base editing: From molecular evolution to therapeutic applications in genomic medicine. Human Gene Therapy, 35(23-24). https://doi.org/10.1089/hum.2024.123
13. Kantor, A., McClements, M., & MacLaren, R. (2020). CRISPR-Cas9 DNA base-editing and prime-editing. International Journal of Molecular Sciences, 21(17), 6240. https://doi.org/10.3390/ijms21176240
14.Crawford, G. (2025). Novel gene-editing technologies: Applications of CRISPR-Cas9, base editing, and prime editing in SCID gene therapy. Journal of Translational Genetics and Genomics, 9(1), 95. https://doi.org/10.20517/jtgg.2025.95
15. Li, M., Lin, Y., Cheng, Q., & Wei, T. (2024). Prime editing: A revolutionary technology for precise treatment of genetic disorders. Cell Proliferation, 57(5), e13808. https://doi.org/10.1111/cpr.13808
16. Chen, P. J., & Liu, D. R. (2023). Prime editing for precise and highly versatile genome manipulation. Nature Reviews Genetics, 24(3), 161–177. https://doi.org/10.1038/s41576-022-00541-1
17. Anzalone, A. V., Randolph, P. B., Davis, J. R., Sousa, A. A., Koblan, L. W., Levy, J. M., Chen, P. J., Webb, C., Newby, G. A., & Liu, D. R. (2019). Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA. Nature, 576(7785), 149–157. https://doi.org/10.1038/s41586-019-1711-4
18. Carroll, D. (2014). Genome engineering with targetable nucleases. Annual Review of Biochemistry, 83(1), 409–439. https://doi.org/10.1146/annurev-biochem-060713-035418
19. Lotfi, M., Morshedi Rad, D., Mashhadi Sharif, S., Ashouri, A., Mojarrad, M., Mozaffari-Jovin, S., Farrokhi, S., Hashemi, M., Lotfi, M., Ebrahimi Warkiani, M., & Abbaszadegan, M. R. (2023). Recent advances in CRISPR/Cas9 delivery approaches for therapeutic gene editing of stem cells. Stem Cell Reviews and Reports, 19(8), 2576–2596. https://doi.org/10.1007/s12015-023-10585-3
20. Barrangou, R., Fremaux, C., Deveau, H., Richards, M., Boyaval, P., Moineau, S., Romero, D. A., & Horvath, P. (2007). CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes. Science, 315(5819), 1709–1712. DOI: https://doi.org/10.1126/science.1138140
21. Makarova, K. S., Grishin, N. V., Shabalina, S. A., Wolf, Y. I., & Koonin, E. V. (2006). A putative RNA-interference-based immune system in prokaryotes: Computational analysis of the predicted enzymatic machinery, functional analogies with eukaryotic RNAi, and hypothetical mechanisms of action. Biology Direct, 1(1), 7. https://doi.org/10.1186/1745-6150-1-7
22. Porto, E. M., Komor, A. C., Slaymaker, I. M., & Yeo, G. W. (2020). Base editing: Advances and therapeutic opportunities. Nature Reviews Drug Discovery, 19(12), 839–859. https://doi.org/10.1038/s41573-020-0084-6
23. Komor, A. C., Zhao, K. T., Packer, M. S., Gaudelli, N. M., Waterbury, A. L., Koblan, L. W., Kim, Y. B., Badran, A. H., & Liu, D. R. (2017). Improved base excision repair inhibition and bacteriophage Mu Gam protein yields C:G-to-T:A base editors with higher efficiency and product purity. Science Advances, 3(8), eaao4774. https://doi.org/10.1126/sciadv.aao4774
24. Komor, A. C., Badran, A. H., & Liu, D. R. (2017). CRISPR-based technologies for the manipulation of eukaryotic genomes. Cell, 168(1–2), 20–36. https://doi.org/10.1016/j.cell.2016.10.044
25. Guha, T. K., Wai, A., & Hausner, G. (2017). Programmable genome editing tools and their regulation for efficient genome engineering. Computational and Structural Biotechnology Journal, 15, 146–160. https://doi.org/10.1016/j.csbj.2016.12.006
