Canlılarla bireysel ve çevresel etkileşimler içerisinde bulunan mikroorganizma topluluklarının oluşturduğu ekosistemlere mikrobiyota, genomlarına da mikrobiyom denilmektedir. İnsanlarda sağlık ve hastalık durumlarında mikrobiyom çeşitliliğinde değişimler gözlemlenmiştir. Örneğin; çocukluk çağı enterik (bağırsak) enfeksiyonlar ve diyarede (ishal) mikrobiyom çeşitliliğinin azaldığı, tümör mikrobiyomunun kanser alt tiplerine göre farklılaştığı bildirilmiştir. Mikrobiyom araştırmalarında sıklıkla kullanılan 16S RNA (ribozomal RNA) dizileme, her ne kadar zaman ve maliyetten tasarruf sağlayan bir yaklaşım olsa da veri analizinde gözlenen mikrobiyom çeşitliliğine dair sahte taksonlar yani yanlış tespit edilen türler klinik ve çevresel yönetim uygulamaları için sorun teşkil etmektedir.
Kumar ve arkadaşları çalışmalarında, 16S rRNA dizileme verilerinde sahte taksonların gözlenmesine neden olan dizi varyasyonunun yakalanamadığı kümeleme modellerine çözüm olarak esnek diferansiyel mikrobiyom zenginlik çıkarımına dayalı Prokounter prosedürünü geliştirmiştir. Öncelikle sahte takson birikimlerinin nedenini anlamak için giriş örneklerinde polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) analizi gerçekleştiren araştırmacılar, geri mutasyonlara izin veren dizileme süreçlerinde oluşan nükleotid ikame (nucleotide substitution) hatalarını matematiksel olarak modelledikten sonra oluşturulan taksonlarda (kümeleme analizi sonucu oluşan kümeler) sadece bazılarının doğru olduğunu göstermiştir. Örneklerdeki cins içi yanlış takson birikiminin kaynak dizinin geri kazanılan çıktı yani bolluğu ile ilişkili olduğu saptanmıştır. Bulgular, geri kazanılan cins bolluğunun bir fonksiyonu olarak tespit edilen alt cins takson sayısının yani hatalı kümelemeye ve örnek derinliğine bağlı oluşan sahte dizi verilerinin yanlış takson birikimine neden olduğunu göstermiştir.
16S rRNA dizilemede genetik segment çözünürlüğünün prokaryotlarla sınırlı kalması, cinslerin gerçek zenginlikleri ile üye taksonların göreceli bollukları arasındaki hatalı ya da taraflı kümelemelere neden olabilmektedir; bu da sağlam bir eğilim tahminini ve zenginlik çıkarımını kafa karıştırıcı bir probleme dönüştürebilmektedir. Çalışmada, cins içi takson birikimlerinin birkaç mikroorganizma için uyumlu olduğu gözlenmiştir. Elde edilen sonuçlar, birçok cinsin benzer takson zenginliğine ve dağılımına sahipmiş gibi algılandığı teknik bir probleme işaret etmiştir. Araştırmacılar daha sonra elde ettikleri bulguları doğrulamak için hedef olarak seçtikleri Pseudomonas aeruginosa popülasyonu üzerinde 16srRNA dizileme gerçekleştirmiştir. Dada2 kümeleme yöntemi kullanılan deneyde, bolluk ekseni boyunca yanlış mikrobiyal keşiflerin biriktiği ve çoğu alt cins taksonun hatalı tespit edildiği doğrulanmıştır. Bu durum, cins bazında diferansiyel zenginlik çıkarımında karışıklığa neden olmaktadır.
Çalışmada, Chao1, ACE, Breakaway, Breakaway_nof1 ve Chiu-Chao gibi mevcut zenginlik tahmin edicilerinin 16S rRNA verilerine uygulanmasında oluşan hataları gidermek ve esnek bir diferansiyel zenginlik çıkarımı yaklaşımı oluşturmak için iki aşamadan oluşan Prokounter geliştirilmiştir. Prokounter stratejisinde temel olarak, yanlış takson birikimini önlemek için bir kontrol kurulduktan sonra oluşturulan bu tahmini kontrol ile standart doğrusal regresyon modelleri diferansiyel zenginlik çıkarımı için kullanılmıştır. Bu sayede, zenginlik istatistikleri bolluk ekseni ile ilişkisiz kılınmıştır.Pseudomonas seyreltme çalışmasında laboratuvar kirleticilerinin ve girdi türlerinin daha fazla örneklenmesine neden olan amplifikasyon döngüleri ve tek bir koloniden türetilmiş mikrobiyal popülasyonun giriş hücrelerinin parametreleri değiştirilerek Prokounter ve mevcut zenginlik tahmin edicileri değerlendirilmiştir. Prokounter’dan elde edilen sonuçlar, giriş hücrelerine göre zenginlikte bir azalma ve amplifikasyon döngülerine göre bir artış göstermiştir. Firmicutes cinsi uzun vadeli zaman serisi çalışmasında da, enterik enfeksiyonlarda enfeksiyon öncesi ve sonrası ilaç kullanımı ile tutarlı tahminler diğer yöntemlere nazaran Prokounter ile elde edilmiştir. Prokounter’ın ekolojik izleme için kullanılabilirliği bir atık su arıtma tesisinden kaynaklanan 16S verilerine uygulanmasıyla değerlendirilmiştir. Diferansiyel bolluk analizini kullanan diğer zenginlik tahmin edicilere göre cinse özgü diferansiyel zenginlik analizi yapan Prokunter ile atık su arıtımının verimliliği konusunda sahte taksonların bertaraf edilmesi sağlanmıştır. Son olarak, Prokounter’ı enfeksiyöz (PIH) ve enfeksiyöz olmayan (NPIH) hidrosefali teşhisi almış çocuklardan alınan beyin omurilik sıvısının (BOS) 16S rRNA dizileme verilerine uygulayan araştırmacılar, PIH örneklerinin kontrollere kıyasla nispeten daha düşük zenginliğe sahip olduğunu tespit etmiştir.
Özetle, mikrobiyom araştırmalarında sıklıkla kullanılan 16S rRNA dizileme verilerindeki bolluk istatistiklerine kümeleme yöntemlerinin sahte taksonlara neden olması, bireysel ve çevresel klinik uygulamalar için karmaşık sonuçlara neden olmaktadır. Bu problemin üstesinden gelmek için geliştirilen Prokounter stratejisi, 16S rRNA dizileme verilerindeki varyasyonları yakalayabilen bir tahmini kontrol verisine dayalı standart doğrusal regresyon algoritmalarının uygulandığı esnek bir diferansiyel zenginlik çıkarımı sağlamaktadır. Çalışma, mikrobiyom analizlerindeki sahte taksonların nedenselliğine ışık tutarken, analizler için yeni bir modelleme önerisi sunmaktadır.
Referans: Kumar, M.S., Slud, E.V., Hehnly, C. et al. Differential richness inference for 16S rRNA marker gene surveys. Genome Biol 23, 166 (2022). https://doi.org/10.1186/s13059-022-02722-x
Yazar: İrem Coşkuntan
Editör: Elif Nur Özcan
-Bioinforange Bilimsel Haber Servisi-
Haber Yazıları, 20> Etki Faktörlü Q1 dergilerinde yayınlanan (listesi için tıklayınız)
bilimsel araştırmaların ekip arkadaşlarımız tarafından incelenip derlenmesi ile hazırlanmaktadır.
Biyolog, Radyoterapi teknikeri. İstanbul Üniversitesi Aziz Sancar Deneysel Tıp Araştırma Enstitüsü / MSc. Genetik, doktora öğrencisi, İ.Ü. Bilgisayar Programcılığı öğrencisi.
İlgi alanları; inflamasyon genetiği, kanser genetiği, hücre biyolojisi, immünoloji, biyoinformatik, biyoistatistik, radyasyon onkolojisi.